Zymo Research DNA Clean & Concentrator™ MagBead Kiti Kullanılarak Otomatik DNA Temizliği

ASSIST PLUS pipetleme robotuyla ultra saf DNA’nızı elde edin !

DNA temizleme yöntemleri, istenmeyen bileşenleri ortadan kaldırarak DNA örneklerini saflaştırmak için kullanılır. Bu, genomik, biyoteknoloji, moleküler biyoloji, klinik araştırma ve biyolojinin diğer alanlarındaki alt süreçlerin başarısı için çok önemlidir.

Zymo Research’ın DNA Clean & Concentrator™ (DCC) MagBead kiti, PCR ve yeni nesil dizileme (NGS) için manyetik boncuk bazlı DNA temizliği sunar. Tek tampon sistemi, DNA’yı enzimatik reaksiyonlardan, saf olmayan ekstraksiyonlardan, kütüphane preparatlarından ve diğer kaynaklardan kurtarabilir. Kit, DNA saflaştırmasını ve konsantrasyonunu otomatikleştirmek ve yüksek verimli işlemeyi mümkün kılmak için ASSIST PLUS pipetleme robotundaki VOYAGER ayarlanabilir uç aralığı pipeti ile birlikte kullanılabilir.

DNA temizleme otomatik protokollerinin sonuçları, birinci sınıf verim ve saflık değerlerinin yanı sıra yüksek tekrarlanabilirlik gösterir.

Yararları

• ASSIST PLUS pipetleme robotunda Zymo’nun DCC’si ile otomatik DNA temizliği, DNA temizliğini çocuk oyuncağı hâline getiriyor. Yalnızca laboratuvar malzemelerinin manyetik ayırıcı ve çalkalayıcı üzerinde açılıp kapatılması sırasında manuel müdahale gereklidir.
• ASSIST PLUS’ın optimize edilmiş sıvı işleme parametreleri, boncuk veya tampon bulaşması olmadan etkili DNA temizliğine olanak tanır. Pipetleme robotunun kullanılması, pipetlemenin her zaman aynı konumdan ve aynı konuma yapılmasını garanti ederek her seferinde tutarlı sonuçlar alınmasını sağlar. Doğru pipetleme yüksekliği, dağıtım öncesi ve sonrası ve ideal pipetleme hızı, sıvıların ve manyetik boncukların dikkatli bir şekilde işlenmesi için iyileştirildi ve istenen sonuçların elde edilmesine yardımcı oldu.
• GRIPTIPS® pipet uçları, VOYAGER pipeti ile mükemmel bir sızdırmazlık oluşturacak ve asla sızıntı yapmamalarını veya düşmemelerini sağlayacak şekilde tasarlanmıştır. Düşük sızdırmazlık GRIPTIPS’in kullanılması, etanol gibi uçucu çözeltilerin hassas şekilde pipetlenmesini garanti eder.
• VIALAB yazılımı kolay programlama sağlar ve sınırlı alan sorununun üstesinden gelmek için laboratuvar malzemesi değiştirme özelliği içerir.
• Yenilikçi laboratuvar gereçleri aksesuarlarımız sayesinde DNA temizleme protokolü basitleştirilebilir. SureFlo™ sızdırmazlık önleme dizisine sahip rezervuarlar, değerli sıvılar için mümkün olan en düşük hacmi sağlar. İkili rezervuar adaptörü, 4 farklı reaktif için bölmelere sahip 2 bölünmüş reaktif rezervuarını barındırır. 96 yuvalı soğutma bloğu değerli reaktifleri soğuk tutar ve tabakadaki PCR plakası için bir saklama yeri görevi görür.
• VOYAGER otomatik uç aralıklı elektronik pipetinin kullanılması, sınırsız esneklik ve farklı laboratuvar malzemesi formatları arasında kolay transfer sağlar.

Genel Bakış: Zymo’nun DCC kitiyle ultra saf DNA nasıl elde edilir?

Adım adım prosedür

ASSIST PLUS pipetleme robotu, nükleik asidi saflaştırmak için bu yarı otomatik iş akışında 8 kanallı 300 µl VOYAGER otomatik uç aralıklı elektronik pipet ve 300 µl steril, filtreli, düşük sızdırmazlık GRIPTIPS ile birlikte kullanılır (Şekil 1).

Şekil 1: Toplam DNA temizleme iş akışı.

Toplam DNA temizleme iş akışı 3 ana adımdan oluşur:

1. Bağlama
2. Yıkama
3. Elüsyon

Deneysel kurulum

A Konumu: 2 bölünmüş rezervuarlı ikili rezervuar adaptörü

B Konumu: PCR soğutma bloğu üzerinde safir 96 yuvalı PCR plakası (Greiner Bio-one)

C Konumu: Thermo Scientific™ Abgene™ 96 yuvalı 0,8 ml polipropilen DeepWell™ plaka

Şekil 2: Ciltleme adımı için plaka kurulumu. Pozisyon A: DNA MagBinding Tamponu (A2 – pembe) ve DNA Yıkama Tamponu (A4 – leylak) içeren 2 bölünmüş rezervuara sahip ikili rezervuar adaptörü. Pozisyon B: Nükleaz içermeyen su (mavi), MagBinding Boncukları (yeşil) ve DNA Elüsyon Tamponu (sarı) içeren bir soğutma bloğu üzerinde 96 kuyucuklu PCR plakası. Pozisyon C: Saflaştırılacak nükleik asitle birlikte 0,8 ml DeepWell plakası (koyu mavi).

Bağlama

Numunelerin hazırlanması, tampon ve manyetik boncuk ilavesi.

İkili rezervuar adaptörünü A konumuna yerleştirin. 2 bölünmüş rezervuarı tabakaya yerleştirin, 10 ml’lik bölmelerden birini 2,2 ml DNA MagBinding Buffer (Şekil 2, pembe) ve diğerini 9 ml DNA Yıkama Tamponu ile doldurun (Şekil 2, leylak). Daha sonra, B pozisyonuna (Şekil 3) nükleaz içermeyen su, MagBinding Boncukları ve DNA Elüsyon Tamponu (sırasıyla Şekil 2, mavi, yeşil ve sarı) içeren 96 yuvalı bir PCR plakası yerleştirin.

Şekil 3: 96 yuvalı PCR plakasının PCR soğutma bloğuna yerleştirilmesi.

Son olarak, 30 µl numuneleri içeren DeepWell plakasını (Şekil 2, koyu mavi) C konumuna yerleştirin.

‘Zymo DCC’ VIALAB programını seçin ve çalıştırın. VOYAGER otomatik uç aralıklı elektronik pipet örneklere 20 µl nükleaz içermeyen su (5 µl ön ve son dağıtma ile) aktaracaktır, böylece saflaştırılacak nükleik asidin başlangıç hacmi DCC kiti üreticisi tarafından önerildiği gibi 50 µl olacaktır. Ardından, doğru hacimde DNA MagBinding Tamponu – giriş DNA hacminin 4 katına karşılık gelir, yani bu durumda 4×50 μl=200 μl – her örneğe eklenir, ardından hız 5’te 10 döngü hassas karıştırma yapılır. MagBinding Boncukları, süspansiyon hâlinde tutulduklarından emin olmak için 10 döngü boyunca iyice karıştırılır ve örneklere 20 µl boncuk eklenir (Şekil 4). Manyetik boncuklar daha sonra 15 döngü boyunca saflaştırılacak nükleik asit ile karıştırılır.

Şekil 4: MagBinding Boncuklarının temizlenecek numunelere eklenmesi.

Bir sonraki adımda pipetleme robotu kullanıcıya DeepWell plakasını 1300 rpm’de 10 dakika boyunca çalkalayıcıya koyması talimatını verir. Bu adım, nükleik asidin manyetik boncuklara bağlanmasını sağlar.

Çalkalamanın ardından pipet üzerindeki bir mesaj, kullanıcıya atık için A (A2) konumuna boş bir rezervuar koymasını ve örnek ve manyetik boncuklarla birlikte DeepWell plakasını C pozisyonundaki manyetik ayırma cihazına yerleştirmesini belirtecektir (Şekil 5).

Şekil 5: DeepWell plakasının manyetik ayırma cihazına yerleştirilmesi.

‘Tamam’a bastıktan sonra, manyetik boncuk harekete geçmek için 2 dakikalık bir inkübasyon takip edecektir. Pipetleme robotu daha sonra otomatik olarak bir sonraki adıma geçerek süpernatantı manyetik ayırma cihazındaki plakadan çıkaracaktır.

İpuçları:

• Hassas pipetlemeyi garanti etmek için bu protokol boyunca sıvı transferlerinde dağıtım öncesi ve sonrası adımlar kullanılabilir.
• Manyetik boncuk kaybını önlemek için süpernatantın çıkarılması sırasında 1 veya 2’lik yavaş aspirasyon hızlarını kullanın.

Yıkama

DNA Yıkama Tamponu ile Saflaştırma.

Pipet, kullanıcıyı manyetik ayırma cihazını çıkarması ve DeepWell plakasını tekrar C pozisyonuna yerleştirmesi için yönlendirir. İlk saflaştırma adımında, 2 transfer adımında 500 µl DNA Yıkama Tamponu eklenir ve manyetik boncuklarla karıştırılır (Şekil 6). Daha sonra pipetin üzerindeki bir mesaj, operatöre DeepWell plakasını manyetik ayırma cihazının C pozisyonuna geri yerleştirmesini ve 2 dakika boyunca inkübe etmesini söyler. İnkübasyonun ardından pipetleme robotu doğrudan bir sonraki adıma geçer ve süpernatantı uzaklaştırır. İlk yıkama adımı tekrarlanır ve ardından kalan yıkama tamponu dikkatlice çıkarılır. Pipet kullanıcıya, manyetik boncukların kurutulması için artık 10 dakikalık bir inkübasyon süresinin gerekli olduğunu bildirir; bu inkübasyon adımı, artık tamponun aşağı yöndeki uygulamaları engellememesini sağlamak için gereklidir.

Şekil 6: Yıkama adımları için deck kurulumu. Pozisyon A: DNA Yıkama Tamponu (A4 – macenta) içeren 2 bölünmüş rezervuara sahip ikili rezervuar adaptörü. Pozisyon C: Manyetik boncuklara (pembe) bağlı nükleik asit içeren 0,8 ml DeepWell plakası.

İpuçları:

• Yıkama tamponu etanol içerir. Damlama olmadan hassas pipetleme için doğru pipetleme hızını, hava boşluğunu ve düşük tutma uçlarını kullandığınızdan emin olun.

Elüsyon

Numunelerin DNA Elüsyon Tamponunda elüsyonu.

Kurutma adımından sonra operatör manyetik ayırma cihazını DeepWell plakasının altından çıkarmalıdır. ASSIST PLUS, 50 µl DNA Elüsyon Tamponu ekleyecek ve ardından 10 karıştırma döngüsü gerçekleştirecektir (Şekil 7). Kullanıcıya DeepWell plakasının 5 dakika boyunca çalkalayıcıya yerleştirilmesi gerektiğini bildiren bir mesaj açılacaktır. Bu, tüm DNA’nın manyetik boncuklardan tampona aktarılmasını garanti eder. Çalkalamanın ardından DeepWell plakası, manyetik boncukların 2 dakikalık inkübasyon sırasında yakalanacağı C pozisyonundaki manyetik ayırma cihazına yerleştirilmelidir. Pipetleme robotu daha sonra kullanıcıya elüt edilen DNA için yeni bir 96 yuvalı plakanın yatay yönde B pozisyonuna yerleştirilmesi gerektiğini bildirecektir. Son adımda pipet, elüt edilen DNA’nın 45 µl’sini yeni 96 yuvalı plakaya aktarır.

Şekil 7: Elüsyon adımı için kurulumu. Pozisyon B: nükleaz içermeyen su (mavi) ile bir soğutma bloğu üzerinde 96 yuvalı PCR plakası. Pozisyon C: Manyetik boncuklara (açık mavi) bağlı saflaştırılmış nükleik asit içeren 0,8 ml DeepWell plakası.

İpuçları:

• Elüe edilen DNA hemen kullanılabilir veya bir sonraki kullanıma kadar -20 °C’de saklanabilir.

Sonuçlar

ASSIST PLUS’taki otomatik DCC MagBead protokolü, PCR’den yüksek DNA geri kazanımı gösterir ve bu, herhangi bir alt uygulamada kullanıma hazırdır. Otomatik iş akışı daha yüksek DNA verimi, daha iyi saflık (A260/A280 ve A260/A230 oranları) ve daha yüksek tekrarlanabilirlik (daha düşük SD değerleri) ile sonuçlandı.

Şekil 8: Bir PCR reaksiyonundan elde edilen DNA, ASSIST PLUS’taki otomatik protokol kullanılarak ve manuel olarak saflaştırıldı. DNA a) verimi ve b) saflığı UV spektroskopisi ile belirlendi. Her numune için N=3.

Notlar

• VIALAB yazılımı: VIALAB programları, kullanıcının özel laboratuvar donanımına ve protokollerine kolayca uyarlanabilir.
• Raporu çalıştır: ASSIST PLUS pipetleme robotu VIALAB ile bilgisayara bağlanırsa programlar doğrudan bilgisayardan başlatılabilir. Bir çalıştırmanın ardından, başlangıç/bitiş zamanı, kullanıcı, hesaplanan hacimler ve meydana gelen hatalar gibi ayrıntıları belgeleyen bir rapor otomatik olarak oluşturulur. Bu, düzenleyici gereklilikleri yerine getirmek için uygun bir yol sunar.

Sonuç

• ASSIST PLUS pipetleme robotu, VOYAGER elektronik pipetle birlikte, düşükten yükseğe kadar verimli numune grupları için Zymo Research DNA Clean & Concentrator MagBead Kitini kullanarak kesintisiz ve etkili bir DNA temizleme çözümü sunar.
• Otomatik pipetleme adımları, insan hatasının ortaya çıkmasını önleyerek yüksek oranda tekrarlanabilir ve güvenilir sonuçlar üretir.
• Yıkama tamponları normalde etanol içerir ancak INTEGRA’nın özel düşük tutmalı GRIPTIPS’i sayesinde bu protokoldeki yıkama adımlarında damlama meydana gelmez.
• Yarı otomatik DNA temizleme iş akışının tamamı, laboratuvar malzemesi değiştirme işlevi kullanılarak tek bir VIALAB programı olarak programlanabilir.
• ASSIST PLUS’ın optimize edilmiş sıvı işleme parametreleri hassas pipetlemeye olanak tanıyarak yüksek DNA verimi ve saflık sağlar.
• Yarı otomatik protokolün sonuçları, DNA verimi ve saflığı açısından manuel protokolle karşılaştırılabilir düzeydeydi. ASSIST PLUS protokolü, standart sapmaların azaltılmasına yardımcı olarak, DNA temizleme sürecinin manuel temizlemeye göre tutarlılığının ve tekrarlanabilirliğinin arttığını gösterdi.

Kaynak:https://www.integra-biosciences.com/germany-austria/en/applications/automated-dna-clean-using-zymo-research-dna-clean-concentratortm-magbead-kit