Virüslerin Saptanması ve Karakterizasyonunda HPLC’nin Rolü Nedir?

HPLC, aşıların geliştirilmesinde viral partiküllerin miktarının belirlenmesi ve karakterizasyonunun yanında hastalığın epidemiyolojisine bakarken farklı viral serotiplere karşılık gelen proteinlerin tanımlanması ve karakterizasyonu için de yaygın olarak kullanılan bir metottur. Bu teknikler nasıl çalışır? Bu tekniklerin, kullanılan en önemli çözücü olan saf su düşünüldüğünde, mümkün olan en doğru sonuçları vermelerini nasıl sağlayabiliriz?

Bir virüs tipik olarak bir protein kılıfın içindeki bir nükleik asit molekülünden oluşur ve sadece bir konağın yaşayan hücreleri içinde çoğalabilir. Virüsler çoğu zaman yanlışlıkla “canlı” olarak adlandırılır, ancak doğru terim konakçı organizmalarının dışındaki “aktif” formlarında hayatta kalamayan parazitler oldukları için “aktif”tir. Bakterilerden çok daha küçüktürler. Örneğin 220 nm çapındaki kızamık virüsü E.coli bakterisinden yaklaşık 8 kat daha küçüktür. Koronavirüs ailesi çok daha da küçük boyutlardadır ve ortalama çapları yaklaşık 120 nm’dir.

Viral kapsid ya da protein kılıf karakteristik proteinlere sahiptir. Konakçı popülasyonunda damlacık enfeksiyonu yoluyla yayılan ilişkili hastalığın yok edilmesi ve söz konusu virüsün ilişkili hastalığa neden olamaması için bu proteinlerin konakçı organizmada bir bağışıklık tepkisi (antikor yanıtı – antibody response) ortaya çıkarması gerekir. “Mutasyon” kelimesi, bir virüsün bağışıklık sistemi tarafından tespit edilmesini engelleyen ve konağın vücuduna saldırmayı sürdürmesini sağlayan bu protein kılıflarındaki küçük değişiklikleri ifade eder. Örneğin, “grip” virüsü o kadar sık mutasyona uğrar ki, araştırmacılar epidemiyologların öncülüğünde belirli bir yılda dünyanın belirli bir bölgesinde hangi virüs türünün etkin olacağını dikkate alarak her yıl yeni bir aşı geliştirmelidir.

Şekil 1. Dünya Sağlık Örgütü’ne göre 2019’un 49. haftasında Avrupa’da yaygın olarak görülen grip virüsü türlerinin çeşitliliği, belirli bir mevsim için ortak bir aşının öngörülüp önerilmesinin ne kadar zor olduğunu göstermektedir.

HPLC ve LC / MS’nin virüslerin karakterizasyonu için bu kadar yararlı olmasının bir nedeni, spesifik antikorları arttırma ihtiyacını ortadan kaldırmaları ve ELISA testlerinin geliştirilmesidir: viral proteinler veya bunların peptitler olarak bilinen kısımları, basitçe bir HPLC kolonunda izole edildikten sonra doğrudan ya da kütle spektrometrisinden sonra analiz edilir.

Viral protein kılıfının bileşenlerinin doğası ve ayrılma derecesi, virüsün yapısına yönelik bir indikasyondur ve influenza virüsü durumunda görüldüğü gibi farklı serotiplerin tespit edilebilecek kadar hassas sonuçlar verir.

Bu nedenle HPLC, salgın hastalıkların araştırılmasında, farklı hastalarda bulunan bir virüsün türlerinin ve alt türlerinin karakterizasyonunu ve ayrıntılı epidemiyolojik haritaların oluşturulmasını sağlayan anahtar bir teknik olarak düşünülebilir. Gezegendeki grip gibi hastalıkları takip etmek için sürekli olarak bu tür haritalar çıkarılır.

Bu şekilde karakterize edilebilen sadece virüsler değildir. HPLC ve LC / MS, farklı bakteri alt türleri için spesifik moleküler parmak izlerini belirlemek için de kullanılabilir, özellikle hastane enfeksiyonlarının kaynaklarını ve antibiyotik direncini izlemek için önemlidir.

Daha sonra viral yükün ölçülmesi ve spesifik viral alt türün karakterize edilmesine yönelik tahminler için belirli bir hasta örneğinde mevcut olan protein veya peptit varlığınınn saptanması ve miktarının belirlenmesi söz konusu olduğunda, çoğu zaman HPLC ve LC / MS deteksiyon limitlerinde çalışır. Bu nedenle, numunelerin hazırlanmasında ve kromatografik çalışmalar için kullanılan çözücülerin mümkün olduğunca saf olması zorunludur. Bu, tüm iş akışı boyunca numuneleri ve tampon çözeltileri hazırlamak için kullanılan suyu kapsar. Ultra saf su kullanımı, bir kromatogramda küçük dikenlerle (spike) karışan hayalet pik noktaları gibi yanlış pozitif bir sonuç yaratabilecek sorunları önleyecektir. HPLC limitleri ve LC / MS test saptama çalışmalarındaki saf suyun önemi, terapötik ilaç izleme ve adli toksikoloji gibi çeşitli uygulamalar için optimize edilmiş testlerin geliştirilmesine daha yakından baktığımız makalemizde daha ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Aşılama: HPLC Viral Vektörlerin Üretiminde Nasıl Kullanılır

Yukarıda, spesifik hastalıkların epidemiyolojisini araştırırken HPLC ve LC / MS testlerinin virüslerin ve bakterilerin miktarının belirlenmesi ve karakterizasyonu için nasıl etkili bir şekilde geliştirildiğini ve optimize edildiğini gördük.

Peki, virüsleri bu kadar düşük miktarlardayken dahi tespit etmek ve hatta alt türlerini karakterize etmek mümkünse, HPLC, virüs bazlı aşılar geliştirirken de yararlı olabilir mi?

Viral bazlı aşı geliştirme demişken, 1796’da 13 yaşında bir çocuğa sığır çiçek hastalığı virüsü aşılayarak çiçek hastalığına karşı bağışıklık göstermesini sağladığı için aşı biliminin kurucusu olarak kabul edilen Edward Jenner’a değinmeden olmaz. 1798’de ilk çiçek hastalığı aşısı geliştirildi. Ancak bir sonraki rutin olarak önerilen aşılar 20. yüzyılın başlarına kadar geliştirilmemiştir. Bunlar, üçü 1948’de birleştirilen ve DTP aşısı olarak verilen boğmaca (1914), difteri (1926) ve tetanosa (1938) karşı koruma sağlayan aşıları içeriyordu. Çocuk felci aşısı 1955’te ruhsatlandırıldı, 1963’te kızamık aşısı geliştirildi ve 1960’ların sonunda kabakulak (1967) ve kızamıkçık (1969) hastalıklarına karşı korunmak için aşılar da mevcuttu.  Kızamık, kabakulak ve kızamıkçık aşıları 1971’de MMR aşısı olarak birleştirildi.

20. yüzyılın sonlarında, moleküler biyoloji önce bir bilim, sonra sürekli kullanılan bir araç olarak değişip geliştikçe, bilim insanları viral parçacıkların insan hücresinin genetik mekanizmasını nasıl ele geçirdiğini incelemeye ve daha fazla aşı geliştirmek için bunu kullanmaya başladılar. Spesifik viral partiküller zayıflatıldıktan sonra insan vücuduna rekombinant nükleik asitleri tanıtmak için bir araç olarak kullanılabilir miydi? Böylelikle, vücut bu nükleik asitlere karşılık gelen proteinleri yaparak hastalığa karşı bağışıklık kazanmak için bir bağışıklık tepkisi ortaya çıkarabilir miydi? Bu sorularla birlikte viral vektörler fikri doğdu.

Viral vektörler hem humoral hem de hücre aracılı bağışıklık tepkilerini etkili bir şekilde tetikleyebilirler. Bunun için spesifik hastalıklara karşılık gelen aşı antijenleri sağlamak ve ayrıca kanser hücrelerini spesifik olarak hedeflemek ve yok etmek için geleneksel platformlara mükemmel bir alternatiftir. İnsan hastalıklarını önlemek ve tedavi etmek için viral vektörlerin başarılı uygulamalarının sağladığı faydalar büyük bir potansiyel teşkil etmektedir. Aslında, bu, yeni koronavirüs, SARS-CoV-2 veya COVID-19 dahil olmak üzere herhangi bir hastalığa karşı aşı bulmak için dünyanın dört bir yanında yarış halinde olan laboratuvarlarda kullanılan umut verici bir yaklaşımdır.

Adenovirüs, bu iddialı görünen rekombinant aşıların geliştirilmesi söz konusu olduğunda çok kullanılan yaygın bir viral vektördür. Adenovirüsler (Ads) gen terapisi uygulamalarında potansiyel kullanımları için kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Bu lineer çift sarmallı DNA virüsünün aşı iletimi için bir vektör olarak kullanılması için temel oluşturan ve yıllar süren araştırmalar sayesinde, Ads aşı geliştirmek için en çok kullanılan vektörlerden biri haline gelmiştir.

Adenovirüsleri bir aşı platformu olarak kullanmanın başlıca avantajları arasında, viral genlerin konakçı genomuna entegre olma ihtimali olmaksızın çok çeşitli konakçılara bulaşma ve yüksek düzeyde transgen ekspresyonu tetikleme yetenekleri bulunmaktadır. Hücre kültüründe yüksek titrelerde büyüme yetenekleri nedeniyle, adenovirüslerin güvenli ve ucuz bir şekilde üretilebilmesi de önemlidir.

Bu tür araştırmalara İngiltere’den bir örnek verelim.  Koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) şiddetli akut solunum sendromunun genom dizilimi Ocak 2020’nin ortalarında kullanılabilir hale gelir gelmez, Sarah Gilbert’ın Oxford’daki ekibi SARS-CoV-2 antijeni oluşturup, bu antijenin bir primat adenovirüs vektörü içine yerleştirilmesi için rekombinant DNA teknikleri kullanarak bir aşı tasarlamak üzere çalışmaya başladı. Aşı, koronavirüsün dışında bulunan “diken” (spike) proteininin genetik dizilimini içerir. Aşılamadan sonra koronavirüsün yüzey diken (spike) proteini üretilir ve bu protein bağışıklık sistemini daha sonra vücuda bulaştığında koronavirüse saldırmak için hazırlar. SARS-CoV-2 aşısı için en uygun aşı teknolojisi olarak bir şempanze adenovirüs aşı vektörü (ChAdOx1) seçildi. Bunun nedeni, yalnızca bir dozla güçlü bir bağışıklık tepkisi (immune response) oluşturabilmesi ve çoğalan bir virüs olmamasıdır.  Böylelikle aşılanmış bireyde devam eden bir enfeksiyona neden olamaz. Bu durum aşıyı çocuklar, yaşlılar ve diyabet gibi önceden mevcut bir sağlık durumu olan herkes için daha güvenli hale getirir. Bu aşının denemeleri Mayıs 2020’de başladı ve bu yıl bitmeden hazır olma olasılığı var.

HPLC ve LC / MS sadece viral vektörler tarafından üretilen rekombinant proteinlerin karakterizasyonunda kullanılmaz, aynı zamanda jel bazlı ve PCR bazlı metotların yanı sıra miktar belirleme ve kalite kontrol için kullanıldıkları aşı üretiminin iş akışındaki temel tekniklerdir. Adenovirüsün saflaştırılmasında yer alan adımlar:

(1) Hücre lizisi ve genomik DNA parçalanması
(2) Klarifikasyon
(3) Ultrafiltrasyon / Diafiltrasyon ile konsantrasyon
(4) Anyon değiştirici (AEX) saflaştırma (Anion-exchange purification)
(5) Jel filtrasyonu
(6) Mikrofiltrasyon

HPLC, bu aşamaların herhangi biri veya tümünde kalite kontrol için kullanılabilir ve işlemin sonunda tespit sınırlarında çalışarak tüm kontaminantların giderilmesini sağlamak için özellikle önemlidir.

Sonuç

Hastalıklarla mücadelemizde yüksek kaliteli HPLC ve LC / MS testlerinin önemi, ister bir hastalığı ilk etapta karakterize etmek isterse potansiyel tedavilerine yönelik aşıların üretimini kontrol etmek için olsun, göz ardı edilemez. Hastalıktaki viral partiküllerin / proteinlerin veya aşılardaki kontaminantların tespit limitlerinin sınırlarında HPLC o kadar sık kullanılır ki, araştırma ve üretimin her aşamasında ultra saf suyun kullanılması garanti edilmelidir. Bunun hakkında daha fazla bilgi edinmek ve HPLC’nin ilaç ve LC / MS uygulamaları için makalelerimizi indirebilirsiniz.

• İlaç endüstrisinde HPLC
• LC / MS’de riski azaltma

Kaynak: https://www.elgalabwater.com/blog/role-hplc-detection-and-characterisation-viruses