Reoloji ve Raman Spektroskopisi Kullanarak Kakao Yağı Kristalleşmesinin İncelenmesi

Uygulamanın Faydaları

Eşzamanlı reoloji ve Raman spektroskopisi (RheoRaman) ölçümleri, kakao yağı (CB) izotermal kristalleşmesini incelemek için kullanıldı. Sonuçlar, CB’nin önce amorf bir katı olarak sertleşerek kristalleştiğini göstermektedir. Amorf katı daha sonra morfolojik bir geçiş geçirerek kristalin bir katıya dönüşmüştür. Bu iki ayrı analitik tekniği birleştirmeden, gözlemlenen amorf–katıdan kristalin–katıya dönüşüm tespit edilmemiş olacaktı. Her bir teknik tek başına tek aşamalı bir süreç önerse de, ancak iki teknik birleştirildiğinde çok fazlalı kristalleşme süreci açığa çıkmıştır. Bu durum, reoloji ile in situ Raman spektroskopisinin birleştirilmesinin ortaya çıkardığı benzersiz analitik yeteneği daha da örneklemektedir.

Giriş

CB (kakao yağı), kakao çekirdeklerinden elde edilen yenilebilir bir bitkisel yağdır. Kakao yağı, ev ve kişisel bakım ürünlerinde (merhemler ve losyonlar gibi) yaygın olarak kullanılır. Ayrıca çikolatanın vazgeçilmez bir bileşenidir, çikolata şekerlemelerinde sürekli fazı oluşturarak çikolatanın dokusunu, kırılmasını, parlaklığını, erime davranışını ve yağlı çiçeklenmeye karşı direncini sağlar. Bu fiziksel özellikler, doğrudan CB’nin triasilgliserol (TAG) bileşimi ve genel kristal yapısıyla ilişkilidir.

Genel olarak, TAG molekülleri bir akordiyon konfigürasyonu alır ve bu TAG akordiyonları, kristal örgü yapıları oluşturacak şekilde bir araya gelir. Kristalleşme sırasında, TAG molekülleri, CB yağının soğumasıyla birlikte yavaşlar ve TAG’ler birbirlerine temas ederek “alt kristalin hücreler” olarak bilinen yapıları oluşturur. Bir kez alt kristalin hücreler oluşturulduğunda, bunlar, daha büyük ve daha kararlı kristal yapılar halinde bir araya gelmek için termodinamik olarak yönlendirilir. Alt kristalin hücre yapıların kendiliğinden bir araya gelmesi ve bunların daha da birleşmesi, moleküller arası ve moleküller içi etkileşimlerin dengesine bağlıdır. Moleküler düzeydeki paketleme ve oryantasyona bağlı olarak, CB farklı kristal örgü yapıları (veya polimorfler) oluşturabilir, bu yapılar arasında bazı kristal yapılar diğerlerinden daha istenilebilir özelliklere sahip olabilir. Genel olarak, CB kristalleşmesi oldukça karmaşık ve çok aşamalı bir süreçtir. CB’nin izotermal kristalleşme davranışını anlamak, çikolata üretim süreçlerini iyileştirmek ve ürün kalitesini korumak için önemlidir.

Bu uygulama notunda, CB’nin izotermal kristalleşmesi incelemek için reoloji ile yerinde Raman spektroskopisi birleştirilmiştir. Raman spektroskopisi, hem sıvı hem de katı TAG (triasilgliserol) yapılarındaki moleküler yapıyı ve konformasyonu, ayrıca intra- ve inter-TAG etkileşimlerini inceleyebilen son derece hassas, nispeten hızlı ve yıkıcı olmayan bir tekniktir. Eşzamanlı Raman spektrumları ve reolojik verilerle, CB’nin izotermal kristalleşmesi sırasında moleküler düzeydeki etkileşimler ve konformasyonel değişimler, hacimsel viskoelastik özelliklerdeki değişikliklerle doğrudan ilişkilendirilmiş ve CB’nin çok yönlü kristalleşme davranışı hakkında benzersiz bir içgörü sağlanmıştır.

Materyaller ve Metot

• Materyaller
  Ticari olarak temin edilebilen organik CB (Theobroma cacao), Inesscents Aromatic Botanicals (Ashland, OR, USA) tarafından temin edilmiştir.
• Raman Spektroskopisi
  Raman spektroskopisi ölçümleri, Thermo Scientific™ DXR3 Flex Raman Spektrometresi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. 532 nm lazer, örnek üzerinde 10 mW lazer gücüyle kullanılmıştır. Spektral aralık 50—3500 cm-1 olarak belirlenmiştir. Spektrumlar, iki saniyelik bir maruz kalma süresi ve dört örnek maruz kalma ile toplanmıştır. Veri toplama ve işleme, Thermo Scientific OMNIC™ Yazılımı ile yapılmıştır. Burada sunulan veriler, OMNIC Series Yazılımının zaman serisi toplama fonksiyonu kullanılarak, belirli bir zaman diliminde, reolojik ölçümlerle paralel olarak ardışık Raman spektrumları toplanarak elde edilmiştir.
• Reoloji
  Reolojik ölçümler, 1 mm gap yüksekliğinde, 35 mm çapında dişli bir plaka rotor ile donatılmış bir Thermo Scientific HAAKE™ MARS 60 Reometresi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Dişli plaka, örnek-rotor arasındaki kaymayı önlemek için kullanılmıştır.

Tüm ölçümler, 1 Hz frekans ve %0.1 sabit deformasyon ile osilatör modunda gerçekleştirilmiştir. CB örnekleri, 60°C’de reometreye yüklenmiş ve örnek yüklemesinden kaynaklanan herhangi bir kristal yapı ve/veya kesme geçmişini silmek için 10 dakika boyunca dengeye gelmesi sağlanmıştır. Denge aşamasından sonra, sıcaklık 60°C’den 22°C’ye hızlı bir şekilde, 10°C/dakika hızında düşürülmüştür. Sıcaklık daha sonra 22°C’de sabit tutulmuş ve her 10 saniyede bir veri toplanarak 120 dakika boyunca ölçümler yapılmıştır.

RheoRaman Eşleşmesi

Thermo Scientific HAAKE™ MARS RheoRaman Sistemi, DXR3 Flex Raman Spektrometresi ve HAAKE MARS 60 Reometre’nin HAAKE RheoRaman modülü ile birbirine bağlanmış bir sistemden oluşmaktadır (Şekil 1). DXR3 Flex Raman Spektrometresi, reometreye serbest alanla optik bir yol ile bağlanmış ve bir dizi ayna kullanılarak gelen lazer ışını RheoRaman modülüne yönlendirilmiştir (Şekil 1). Modül içinde, bir ayna lazer ışınını 20x objektife yönlendirmiş ve lazer ışığı örneğe doğru odaklanmıştır (akış veya sarmal düzlemine dik olarak). Geri yansıyan Raman ışığı aynı 20x objektif kullanılarak toplanmış ve aynı optik yol ile spektrometreye geri yönlendirilmiştir, sonunda spektrometre içinde yer alan spektrografa ulaşmıştır (Şekil 1).

Örnek, kumlanmış cam alt plaka ve dişli 35 mm plaka rotorunun arasına yerleştirilmiş, örnek-levha arayüzlerinde kaymayı engellemek için dokulu plakalar kullanılmıştır. RheoRaman modülündeki bir elektrikli ısıtıcı eleman, örneğin alt kısmından sıcaklık kontrolünü sağlamıştır, üst kısmında ise aktif bir elektrikli kapak kullanılarak sıcaklık kontrolü sağlanmış ve örnek içinde sıcaklık gradyanı oluşma olasılığı ortadan kaldırılmıştır. Örneklerin soğutulması, sıcaklık kontrollü su banyosu dolaştırıcısı ile sağlanmıştır.

Şekil 1. (a) Thermo Scientific HAAKE™ MARS RheoRaman Sistemi için RheoRaman modülü. (b) MARS RheoRaman Sisteminin şematik diyagramı (reometre numune aşamasının yan ve üst görünümlerini göstermektedir). DXR3 Flex Raman Spektrometresi, ışığı 20x objektife yönlendiren lens tüpleri ve aynalar kullanılarak MARS reometresine serbest alanla bağlanır. Objektif, gelen lazeri (yeşil kesikli çizgi) odaklar ve reometre aşamasının üstünde oturan numuneden çıkan geri saçılmış Raman ışığını (sarı) toplar.

Sonuçlar ve Tartışma

Raman Spektroskopisi: CB Kristalizasyonu
500–3000 cm-1 aralığındaki sıvı faz CB erimesi ve kristalin katı CB için Raman spektrumları Şekil 2’de gösterilmektedir. Hem C–H gerilme bölgesinde (2700–3050 cm-1) hem de parmak izi bölgesinde (1000–1800 cm-1) belirgin Raman özellikleri gözlemlenmiştir. Özellikle, daha düşük Raman kayma özellikleri şunları içermektedir: karbonil (C=O).

Şekil 2. Erimiş ve kristal CB’nin tam Raman spektrumları.

Şekil 3. Erimiş ve kristal CB için C-H germe bölgesinin (2700-3050 cm-1) Raman spektrumları.

C-H gerilme bölgesi kadar yoğun olmasa da, parmak izi bölgesinde (1000–1800 cm-1) yaklaşık sekiz benzersiz spektral özellik tespit edilmiştir (Şekil 4). CB erime hali ile kristalin fazı karşılaştırıldığında, en belirgin değişiklikler C–C gerilme bölgesinde (1000–1200 cm-1) gözlemlenmiştir. Ayrıca, 1700–1800 cm-1 aralığında gerilme bölgesi, ~1655 cm-1’deki olefinik (C=C) bandı, CH3 ve CH2 deformasyonları (~1460 ve 1440 cm-1 sırasıyla), CH2 burulma bölgesi (1250–1300 cm-1) ve C–C gerilme bölgesi (1000–1200 cm-1) de belirgin özelliklerdendir.

Erimiş ve katılaşmış CB örnekleri için C-H gerilme bölgeleri Şekil 3’te vurgulanmıştır. ~2850 cm-1 ve 2882 cm-1’de iki güçlü pik gözlemlenmiştir. Bunlar, sırasıyla simetrik ve asimetrik CH2  gerilmesini temsil etmektedir. 2850 cm-1’deki simetrik titreşim modları sıvı (erimiş) fazında baskınken, 2882 cm-1’deki asimetrik titreşimler katı fazda baskın olmuştur.

Bu şekilde, 2850 cm-1 ve 2882 cm-1 bantları sırasıyla amorf ve kristalin içeriğin güçlü göstergeleridir.3 Daha sonra, I2882/I2850 pik yoğunluk oranı, in situ RheoRaman ölçümleri sırasında kristal oluşumunu dinamik olarak izlemek için kullanıldı.

Katılaşma süreci sırasında 1130 cm-1 ve 1063 cm-1’de iki belirgin özellik ortaya çıktı; bunlar sırasıyla simetrik ve asimetrik C-C gerilmelerinden kaynaklanıyordu.4,5 Erimiş fazda, tüm C-C gerilme bantları, metil gauchekonformasyonlarının düzensizlik etkileri nedeniyle nispeten zayıf ve genişti.

Şekil 4. Erimiş ve kristal CB için 1000-1800 cm-1 Raman spektral aralığı.

Ancak, CB katılaştıkça, omurga metil grupları trans-konformasyon düzenine girdi ve bu, 1130 cm-1’deki pikle belirtilmiştir. Bu nedenle, I2882/I2850 pik yoğunluk oranının yanı sıra, I1130/I2850 spektral işareti de CB’deki kristalin faz geçişini izlemek için in situ RheoRaman ölçümleriyle kullanıldı.

Eşzamanlı reoloji ve Raman spektroskopisi (RheoRaman)

CB’nin erimiş fazdan katı faza geçişi, küçük genlikli osilasyonel kesme ölçümleri kullanılarak reolojik olarak incelendi (Şekil 5a). Burada, depolama modülü (G’) ve kaybı modülü (G”) zamanın bir fonksiyonu olarak, 22°C izotermal sıcaklıkta ölçüldü. G’ ve G”, bir malzemenin elastik ve viskoz davranışlarını sırasıyla ölçen parametrelerdir. Sıvı benzeribir malzeme, elastik olandan daha viskoz olacaktır (yani, viskozitesinin baskın olduğu durum), bu nedenle G”, G”den daha büyük olacaktır. Buna karşılık, katı benzeri bir malzeme, elastik davranışı viskoz davranıştan daha fazla sergiler (yani, elastik olarak baskın olur), bu da G”nin G”‘den büyük olduğu anlamına gelir. G’ ve G”‘nin genel büyüklükleri ile bunların büyüklük farkı, genellikle G” / G’ oranı olarak raporlanır ve belirli bir malzemenin genel viskoelastik özellikleri ve deformasyona karşı direnci hakkında bilgi verir.

G”/G’ oranı (Şekil 5a’nın sağ y-ekseni üzerinde çizilen) genellikle bir malzemenin viskoelastiğini izlemek için kullanılır: burada δ faz açısı, giriş gerilmesi ile sonuçlanan gerilme sinüs dalgaları (veya tersine) arasındaki kayma veya gecikme olarak tanımlanır. “tan(δ)” terimi genellikle kayıp veya sönüm faktörü olarak adlandırılır. tan(δ) değeri birden küçük olanlar, elastik olarak baskın (katı benzeri) davranışı, birden büyük olanlar ise viskoz olarak baskın (sıvı benzeri) davranışı gösterir.

Bireysel modüllerin aksine, tan(δ) bir malzemenin genel kırılganlığını nicelleştirmek için kullanılabilir ve genellikle cam geçişi davranışını değerlendirmek için kullanılır. Genel olarak, tan(δ) değeri küçüldükçe, G’ değeri G”’den daha fazla sapar ve malzeme daha kırılgan (veya cam benzeri) hale gelir.

CB’nin izotermal tutma süresinin başlangıç kısmı

İzotermal tutma süresinin 0-5 dakika arasındaki ilk kısmında (**60°C’den 22°C’ye hızla düşen sıcaklığın hemen ardından), hem G’ hem de G” arttı çünkü CB, erimiş sıvıdan yumuşak bir yarı katıya dönüştü (Şekil 5a). Modüldeki bu ilk artış, muhtemelen set sıcaklığı ile yüklenen örneğin iç sıcaklığı arasındaki bir gecikmeden kaynaklanıyordu. Örnek, 22°C izotermal set noktasına ulaştığında ve termal dengeye geldiğinde, modüller 10-25 dakika boyunca nispeten stabil kaldı.

Bununla birlikte, 25-50 dakika arasında hem G’ hem de G” kademeli olarak artmaya başladı ve sonra 50-80 dakikaarasında modüller hızlı bir şekilde arttı, burada G’ ve G” sırasıyla yaklaşık 5 ve 4 büyüklük sırasıyla arttı. Modüllerdeki üssel artış, bir katılaşma sürecini gösterir; burada CB, esnek bir yarı katıdan daha sağlam, sert bir katıya dönüştü. 80 dakikadan sonra, elastik modüldeki artış yavaşladı ve sonunda platoya ulaştı, 100 dakikadan sonra daha fazla belirgin bir değişiklik göstermedi. Ancak, viskoz modül 80-100 dakika arasında hafif bir platoya ulaştı ve ardından 100 dakikadan sonra kademeli olarak azalmaya başladı.

G’ ve G”’deki artış sırasında, tan(δ) kayıp faktörünün yaklaşık 65. dakikadan sonra hızlı bir şekilde azaldığı gözlendi (Şekil 5a, sağ y-ekseni). Kayıp faktöründeki azalma, G’ ve G” arasındaki genel büyüklük farkındaki sapmayı gösterir. CB sertleştikçe, G’’deki artış G”’deki artışı geçti ve bu da tan(δ)’nin azalmasına yol açtı. 120 dakikalık izotermal çalışmanın sonunda, G’ G”’den bir tam büyüklük sırası daha büyük oldu ve kayıp faktörü 0.01’e yaklaştı, bu da CB’nin kırılgan bir cam benzeri katıya dönüştüğünü gösterdi.

Şekil 5. (a) Reoloji: G’ ve G” (sırasıyla dolu ve açık daireler; sol y ekseninde çizilmiştir) ve tan(δ) (sağ y ekseninde çizilmiştir) ve (b) Raman: 22°C’de izotermal kristalleşme sırasında CB için I1130/I2850 (sol y ekseni, yeşil) ve I2882/I2850 (sağ y ekseni, siyah) pik yoğunluk oranları. Dikey kesikli çizgi 45 dakikada G’ ve G” artışını gösterirken, kesikli çizgi 65 dakikada tan(δ) düşüşünü ve Raman oranlarındaki artışı göstermektedir.

Gözlemlenen reolojik davranış, eşzamanlı Raman spektroskopisi kullanılarak daha da doğrulandı (Şekil 5b). Başlangıçta, I1130/I2850 ve I2882/I2850 pik yoğunluk oranları, izotermal çalışmanın ilk ~65 dakikası boyunca değişmeden kaldı. Ardından, I1130/I2850 ve I2882/I2850 oranlarında ~65. dakikada keskin bir artış başladı, bu da CB içinde kristal yapılarının oluştuğunu gösteriyordu. CB daha fazla kristalleştikçe, her iki spektral işaretçi de 65 ila 100 dakika arasında artmaya devam etti. 100 dakikadan sonra, her iki Raman özelliğindeki büyüme azalmış ve pik yoğunluk oranları stabilize olmaya başlamıştır.

Genel olarak, 1130 ve 2882 cm-1 spektral oranlarındaki artış hızı, hem G’ hem de G” için gözlemlenen değişim hızıyla benzerdi (yani, benzer eğimlerle arttılar). Ancak, G’ ve G”’de gözlemlenen artış ile Raman yoğunluk oranlarındaki artış arasında fark edilebilir bir 15-20 dakikalık bir gecikme vardı. G’ ve G”’deki keskin artış, deformasyona karşı artan bir direnç gösteriyor (yani, CB’nin hacimsel sertleşmesi), bu da katılaşma sürecinin başladığını belirtiyor. Öte yandan, Raman spektral işaretçileri, kristal oluşumunu gösteriyor. Bu nedenle, reoloji ve Raman profilleri arasındaki zaman gecikmesi, CB’nin ilk olarak amorf bir katı hale geldiğini, ardından amorf bir katıdan kristalin bir katıya dönüşümünü gösteriyor. Bu morfolojik dönüşüm, kristal CB yapılarıyla ilişkili Raman bantlarının (1130 ve 2882 cm-1 pikleri) sonraki artışıyla belirtildi. Reolojik ve Raman spektral profillerinin zamansal ayrılması, CB’nin hacimsel sertleşmesi ile kristalin bölgelerin oluşumu arasında açık bir ayrım olduğunu gösteriyor.

İlginç bir şekilde, Raman spektral özelliklerindeki artış (I1130/I2850 ve I2882/I2850) doğrudan tan(δ)’de gözlemlenen azalma ile ilişkilidir (Şekil 5). Kayıp faktörü, malzemenin kırılganlığının bir göstergesidir ve kristalin yapılar genellikle kırılgandır. Bu nedenle, moleküler düzeyde kristal alanlarının oluşumunun (Raman ile gösterildiği gibi) CB’nin genel kırılganlığı ile örtüşmesi mantıklıdır. Sonuç olarak, kayıp faktörü, yalnızca G’ ve G”’ye kıyasla, CB’nin hacimsel kristalleşmesinin daha açıklayıcı bir göstergesi olabilir.

Sonuç

Eşzamanlı reoloji ve Raman spektroskopisi ölçümleri, CB’nin izotermal kristalleşmesini incelemek için kullanıldı. Bu çok modlu analitik teknik, CB’nin hacimsel mekanik özellikleri (G’, G”, ve tan(δ)) ile moleküler düzeydeki konformasyonel değişikliklerin (2882 cm-1’deki νas(CH2) modu ve 1130 cm-1’deki νs(C-C) modu) gerçek zamanlı olarak doğrudan ilişkilendirilmesine olanak sağladı. Hızlı soğutma (10°C/dakika) sonrası ve 22°C izotermal sıcaklıkta, reolojik yanıt (G’ ve G”) ile Raman spektral profilleri arasında fark edilebilir bir zaman gecikmesi gözlemlendi. Gözlemlenen zaman gecikmesi, CB’nin önce amorf bir katı olarak sertleşerek kristalleştiğini, bunun G’ ve G”’deki keskin bir artışla kendini gösterdiğini, ancak Raman özelliklerinin değişmeden kaldığını gösteriyor.

Amorf katı daha sonra, kristal CB yapılarına ait Raman özelliklerinin (1130 ve 2882 cm-1) artışıyla gösterilen, kristal bir katıya dönüşen morfolojik bir geçiş geçirdi. Bu iki ayrı analitik tekniği birleştirmeden, gözlemlenen amorf katıdan kristalin katıya dönüşüm tespit edilemezdi. Her bir teknik tek başına tek aşamalı bir süreç önerirken, yalnızca bu iki teknik birleştirildiğinde çok aşamalı kristalleşme süreci ortaya çıkar ve reoloji ile in situ Raman spektroskopisinin birleşmesinin sunduğu eşsiz analitik yetenek daha da örneklendirilmiş olur. Bu çalışma CB’nin izotermal kristalleşmesine odaklanmış olsa da, burada uygulanan temel ilkeler, jelasyon, polimerleşme, kürleşme davranışı ve diğer kayma etkili fenomenler gibi geniş bir malzeme işleme yelpazesi için uygulanabilir olmalıdır.

Kaynak: ThermoScientific