PCR Analizlerinizi Geliştirmek İçin İpuçları

PCR nedir?

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), aşağı akış uygulamalarında kullanılmak üzere spesifik DNA dizilerini amplifiye etmek için kullanılır. PCR tekniğini bulan Kary Mullis’in PCR üzerine patenti 1987’de onaylandıktan altı yıl sonra Nobel Kimya Ödülü’ne layık görüldü ve bu zamandan beri PCR en temel moleküler biyoloji tekniklerinden biri olarak kaldı. Birkaç örnek vermek gerekirse; genetik mühendisliği, genotipleme, dizileme ve ailesel ilişkilerin tanımlanması onsuz mümkün olmazdı.

PCR reaksiyonlarını gerçekleştirmek için bir master mix hazırlamanız, şablon (template) DNA eklemeniz ve bir termal cycler (döngüleyici) kullanarak ilgilenilen diziyi amplifiye etmeniz gerekir. Aşağıdaki bölümlerde, master mix bileşenlerinin neler olduğunu ve termal döngüler sırasında şablon DNA ile nasıl etkileşime girdiklerini açıklayacağız.

PCR karışımı (master mix) bileşenleri nelerdir?

PCR master mix altı farklı bileşenden oluşur:

PCR dereceli su (ultra saf su) – kirletici, nükleaz ve inhibitör içermemelidir.

dNTP’ler – ilgili DNA dizisinin tamamlayıcı kopyalarını oluşturmak için “yapı taşları” olan dört nükleotidi (dATP, dCTP, dGTP ve dTTP) içerir.

İleri (forward) ve ters (reverse) primerler – kısa, tek iplikli DNA dizileri, şablon DNA’nın artı ve eksi ipliklerini yeniden birleştirir ve amplifiye edilecek diziyi kuşatır.

DNA polimeraz – Taq-polimeraz, tipik olarak PCR reaksiyonları için kullanılan enzimdir. İlgili DNA dizisinin tamamlayıcı (complementary) kopyalarını oluşturmak için dNTP’leri kullanır.

Tampon – 8.0 ve 9.5 arasında bir pH ile DNA polimeraz için uygun bir ortam sağlanır.

Magnezyum klorür – DNA polimerazın aktivitesini artırmak ve primerlerin daha yüksek bir amplifikasyon oranı için şablon DNA’ya bağlanmasına yardımcı olmak için bazen tampona yeterli konsantrasyonda dahil edilir.

Master mix hazırlandıktan sonra eklenen şablon DNA, genomik DNA (gDNA), tamamlayıcı DNA (cDNA) veya plazmit DNA olabilir.

PCR'nin 3 adımı

Numunelerinizi termal döngüleyiciye yükledikten sonra aşağıdaki aşamalardan geçerler:

Denatürasyon (Denaturation): Termal döngüleyici ilk önce şablon DNA’yı denatüre etmek için reaksiyon karışımını 95 °C’ye ısıtır ve onu iki tek sarmal halinde ayırır. Bu genellikle ilk termal döngü sırasında yaklaşık 2 ila 5 dakika ve sonraki termal döngüler için 10 ila 60 saniye sürer.

Bağlanma (Annealing): Sıcaklık düşürüldüğünde, primerler, ilgili şablon DNA bölgesini kuşatan dizilere bağlanır. Bu adım 30 ila 60 saniye sürer ve optimum bağlanma/yapışma sıcaklığı, primerlerin erime sıcaklığına bağlı olarak tipik olarak 45 ila 60 °C arasındadır.

Uzatma (Extension): Sıcaklık, DNA polimeraz için ideal çalışma sıcaklığı olan 72 °C’ye yükseltilir. İlgili DNA dizisinin tamamlayıcı kopyalarını oluşturmak için genellikle 20 ila 60 saniye gerekir.

Başlangıçta bulunan DNA miktarına ve PCR sonrası uygulamalar için gereken amplikon kopya sayısına bağlı olarak yaklaşık 25 ila 40 döngü gerçekleştirilir.

PCR için ipuçları ve püf noktaları

Bir PCR reaksiyonu kurmak basit görünebilir ancak basit olmaktan çok uzaktır. Doğru konsantrasyonda doğru hacmi elde etmek için gerekli master mix reaktiflerinin miktarını doğru bir şekilde hesaplamak ilk zorluktur.

Bu gerçekleştirildikten sonra reaktiflerin birlikte karıştırılması gerekir. Buradaki zorluk, sıvıların genellikle soğutulmasının gerekmesi ve genellikle çok viskoz, yapışkan olmalarının yanı sıra minimum miktarlarda ihtiyaç duyulmasıdır. Ayrıca, dikkat dağınıklığı veya çalışmadaki kesintiler, master mixe hangi reaktiflerin eklendiğini artık bilemediğiniz bir duruma yol açabileceğinden çalışma yoğun bir odaklanma gerektirmektedir. PCR strip tüplerini veya plakalarını master mixle doldururken ve şablon DNA eklerken, özellikle tek kanallı pipetlerin kullanılması tüp veya kuyucuk atlama gibi hatalara da kolayca yol açabilir.

Son ve muhtemelen en büyük zorluk, PCR reaksiyonlarınızı kontaminasyondan uzak tutmaktır. PCR, küçük bir miktardaki başlangıç materyalinden çok sayıda nükleik asit kopyası oluşturabilen çok hassas bir analizdir, bu nedenle amplikon ve numune kontaminasyonu çok büyük bir problem olabilir.

PCR için master mix nasıl hesaplanır?

Önce bir PCR master mixi hazırlamak için gereken matematiksel hesaplamalara bir göz atalım. Her biri 50 µl hacimli birkaç PCR reaksiyonu kurmak istediğinizi varsayacağız.

Her reaktif için gerekli hacmi hesaplamak üzere gerekli bileşenlerle bir tablo oluşturmak (bkz. Tablo 1) ve tampon, MgCl2, dNTP’ler ve primerler için stok konsantrasyonları ve istenen son konsantrasyonlarıyla bu tabloyu doldurmak en iyisidir. Ardından, stok konsantrasyonunu son konsantrasyona bölerek seyreltme faktörlerini hesaplayın. Tek bir PCR reaksiyonu için gereken hacmi belirlemek için istenen reaksiyon hacmini seyreltme faktörüne bölün.

Polimeraz için biraz farklı bir denklem gereklidir. Enzim üreticisi size polimeraz miktarını bir µl’ye düşen polimeraz miktarı olarak belirtecektir, örn. 5 Birim/µl. Bu değeri stok konsantrasyonu sütununa ve istediğiniz miktarı (örn. 1.25 Birim) son konsantrasyon sütununa girin. İhtiyaç duyulan hacim daha sonra şu şekilde hesaplanabilir: 1.25 Birim x (1 µl / 5 Birim) = 0.25 µl.

Gerekli şablon DNA hacmi, numune türünüze bağlıdır. Yaklaşık 1 pg ila 10 ng plazmit veya viral DNA ve 1 ng ila 1 μg genomik DNA eklemelisiniz. Aşağıdaki örnekte, 0,5 µl 1 µg/µl şablon DNA için ne kadar kullanmanız gerektiğini hesapladık.

Son olarak, tüm reaktifler için gerekli hacimleri ekleyin. İstenen toplam reaksiyon hacmi (50 µl) ile elde edilen sonuç arasındaki fark, size PCR için gerekli olan ultra saf su hacmini verir.

Reaktif	Stok Konsantrasyonu	Nihai Konsantrasyon (CF)	Seyreltme Faktörü (= Stok Konsantrasyonu / CF)	Gerekli Hacim (= 50 µl / Seyreltme Faktörü)
Tampon	10X	1X	10	5 µl
MgCl2	25 mM	1.5 mM	16.66	3 µl
dNTP’ler	10 mM	0.2 mM	50	1 µl
İleri (forward) primer	10 µM	250 nM	40	1.25 µl
Ters (reverse) primer	10 µM	250 nM	40	1.25 µl
Polimeraz	5 Birim/µl	1.25 Birim	–	0.25 µl
Şablon DNA	1 µg/µl	–	–	0.5 µl
PCR dereceli su (ultra saf su)	–	–	–	37.75 µl

Tablo 1: PCR master mix hesaplama tablosu örneği

Bir PCR reaksiyonu için gerekli reaktif hacimlerini belirledikten sonra tüm PCR kurulumu için toplam hacimleri elde etmek üzere bunları numune sayınızla (artı negatif ve pozitif kontrollerle) çarpabilirsiniz. Master mixin bir kısmı buharlaşma, pipet ucuna yapışma veya pipetleme hataları nedeniyle pipetleme sırasında kaybolabileceğinden bu sonuca bir parça eklemenizi öneririz.

İşte bu kadar, şimdi aşağıda listelenen en iyi pipetleme uygulamalarını izleyerek PCR reaksiyonlarınızı kurmaya hazırsınız.

PCR için en iyi pipetleme uygulamaları

Şablon DNA dışında yukarıda listelenen tüm bileşenlerden oluşan master mixini hazırlayarak başlayın. Bir PCR çalışması için gereken tüm master mix miktarını hazırlamanın ve ardından tek alikotları PCR striplerine veya plakalarına aktarmanın en büyük avantajı, daha yüksek hacimleri daha doğru bir şekilde pipetleyebilmenizdir. Bunun da ötesinde, pipetleme adımlarını azaltarak tüm süreci daha az yorucu ve daha az hataya açık hale getirir. Pipetleme hataları tamamen ortadan kaldırılamayacağı için master mix bileşenlerini fiyatlarına göre en uygun fiyatlı reaktiften başlayarak eklemelisiniz. Bu şekilde, baştan başlamak zorunda kalırsanız daha az para harcamış olursunuz.

Master mixiniz tamamlandıktan, iyice karıştırıldıktan ve tüplere veya plakalara dağıtıldıktan sonra şablon DNA’yı ekleyebilirsiniz. DNA örnekleri genellikle oldukça viskoz ve küçük miktarlarda gerekli olduğu için bunları ya master mixe veya tüpün ya da kuyucuğun duvarına dağıtmalısınız. Şablon DNA’yı dağıttıktan sonra kalan sıvıyı çıkarmak için ucu yavaşça laboratuvar gerecinizin duvarı boyunca sürüklerken pistonu basılı tutun. Ayrıca, düşük sızdırma özelliğine sahip düşük retansiyonlu pipet uçları kullanmanızı öneririz.

Sıcak başlangıçlı bir polimeraz kullanmıyorsanız, spesifik olmayan amplifikasyonu önlemek için master mix hazırlama ve numune ekleme işleminin tamamı boyunca reaktiflerinizi soğutun.

Numunelerinizi termal döngüleyiciye yüklemeye hazır olduğunuzda sıkıca kapatıldıklarından emin olun ve amplifikasyon sırasında laboratuvar gereçleri duvarında damlacık kalmamasını sağlamak için numunelerinizi aşağı doğru döndürün.

PCR reaksiyonları için pipetleme çözümleri

Çeşitli pipetleme çözümlerini tartışmadan önce sıvı işleme ve dağıtımının en önemli yönlerinden birine değinmek istiyoruz. Hangi pipetleri seçerseniz seçin düzenli kalibrasyon ve kullanımlar arasında performanslarını kontrol ederek iyi durumda olduklarından emin olun.

Master mix hazırlamak için en uygun fiyatlı pipetler, manuel tek kanallı modeller olacaktır. Ancak birden fazla çok pahalı reaktifi doğru bir şekilde ölçmeniz ve karıştırmanız gerektiği için elektronik tek kanallı pipetlere yatırım yapmanızı öneririz. Elektronik pipetlerin motor kontrollü piston hareketi, pipetlemenin hassasiyetini ve doğruluğunu artırmak için değişkenliği en aza indirerek her zaman tam olarak istenen hacmi dağıtmalarını garanti eder.

Kap için, master mixi bir tüp içinde veya elektronik çok kanallı bir pipetle aktarmayı düşünüyorsanız düşük ölü hacimli bir reaktif rezervuarında hazırlayabilirsiniz. Çok kanallı elektronik pipet ve rezervuar kombinasyonu bu adım için idealdir çünkü aynı anda birkaç tüp veya kuyucuğu doldurabilirsiniz. Bunun da ötesinde, çok kanallı elektronik pipetler genellikle tekrar dağıtma moduna sahip olduğu için master mixten yüksek bir hacmi aspire edebilir ve ardından hacmi çok sayıda küçük alikuota dağıtabilirsiniz. İş yükünüz azsa tek kanallı elektronik pipet kullanmak da mümkündür.

Master mix alikuotlarına şablon DNA eklemek için numunelerinizin bulunduğu laboratuvar gereci formatı PCR amplifikasyonu için kullanılan kap ile birbirine uymuyorsa aralıkları ayarlanabilir pipetler çok kullanışlı olabilir. Örneğin, mikrosantrifüj tüplerinden birden fazla şablon DNA örneğini tek adımda 96 kuyucuklu bir plakanın tüm satır veya sütunlarına aktarabilirsiniz.

İş yükü yüksek laboratuvarlar master mix plakaya aktarma ve numune dağıtımı için elektronik pipetleri otomatik hale getiren bir pipetleme platformu gibi otomatik çözümlerden de yararlanabilirler.

ASSIST PLUS pipetleme robotu, master mixi 384 kuyucuklu bir PCR plakasına aktarırken

PCR kontaminasyonu nasıl önlenir?

Master mixinizin veya şablon DNA’nızın önceki PCR’ler sırasında oluşturulan amplikonlarla kontamine olmaması için çeşitli önleyici tedbirler alınmalıdır.

En etkili yollardan biri, master mix hazırlama, şablon DNA ekleme, amplifikasyon ve analiz alanlarını birbirinden fiziksel olarak ayırmak ve laminer akış veya biyogüvenlik kabinlerinde çalışmaktır. Her çalışma alanı ve ilgili ekipmanı, bir çalışmadan önce ve sonra temizlenmeli ve bir alanda kullanılan aletler asla başka bir alana girmemelidir. Bir PCR laboratuvarının ideal kurulumu hakkında daha fazla bilgi edinmek için “Bir PCR Laboratuvarı Nasıl Kurulur?” başlıklı blog yazımızı okuyabilirsiniz.

Sarf malzemeleri söz konusu olduğunda, DNase, RNase ve PCR inhibitörleri içermediği onaylanmış steril ürünler satın aldığınızdan emin olun. Pipet uçları sızdırdığında veya düştüğünde oluşabilecek kontaminasyonu önlemek için pipetle mükemmel bir sızdırmazlık sağlamalıdır. Filtreli pipet uçlarının kullanılması aerosollerin pipetlerinize girme ve sonraki PCR reaksiyonlarını kirletme riskini de önleyecektir.

Siz de potansiyel bir kontaminasyon kaynağı olduğunuz için enzimlerin, mikropların ve cilt hücrelerinin reaksiyona girmesini önlemek için daima eldiven giyin ve bir bölgeden diğerine giderken bunları değiştirin. Bunun da ötesinde, tüm PCR kurulumu sırasında tüplerinizi mümkün olduğunca kapalı tutun.

Bu önleyici tedbirlere rağmen PCR reaksiyonlarınızın kontamine olma olasılığını tamamen ortadan kaldıramazsınız. Böyle bir durumda belirli bir reaktifin tüm stoğunu atmak zorunda kalmamak için master mix bileşenlerinizin tek kullanımlık alikotlarını hazırlayın. Ayrıca, kantitatif PCR (qPCR) testleri için standartların seri seyreltmelerinin yanı sıra pozitif ve negatif kontrollerin alikotlarını önceden hazırlayabilirsiniz. Tekrar dağıtma ve seri seyreltme modlarına sahip elektronik pipetler, bu görev için yalnızca kontaminasyon riskini azaltmakla kalmaz, aynı zamanda PCR kurulumunun verimliliğini artırmak için de yardımcı olabilir.

Sonuç

PCR, araştırma, tanı ve adli tıpta temel bir tekniktir. Genellikle zorlu özellikleri bulunan reaktiflerin küçük hacimlerini pipetlemeyi içerir, bu nedenle istenen sonuçları elde etmek zor olabilir. Bunun da ötesinde, çok hassas bir test olduğu için kontaminasyonun sonuçlar üzerinde büyük bir etkisi olabilir. Bu makalede sağlanan ipuçları ve püf noktalarının PCR reaksiyonlarınızın daha başarılı hale gelmesinde yardımcı olacağını umuyoruz. Bu önerilerin çoğu, ters transkripsiyon ve qPCR, döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) ve helikaz bağımlı amplifikasyon (HDA) gibi diğer amplifikasyon testlerine de uygulanabilir.

Kaynak: https://www.integra-biosciences.com/global/en/blog/article/simple-pcr-tips-can-make-or-break-your-success