Nükleik Asitlerin Saflık ve Konsantrasyonunun Belirlenmesi

Agaroz Jel Elektroforezi Nedir?

Jel elektroforezi: Jel elektroforezi, DNA, RNA veya proteinler gibi molekülleri boyut ve yüklerine göre ayırmak için kullanılan bir tekniktir. Numuneler jelin bir ucundaki kuyucuklara yüklenir ve elektrik akımı uygulanır. Moleküllerin yük ve boyutlarına bağlı olarak jel içerisinde daha hızlı veya daha yavaş hareket ederek birbirlerinden ayrılmaları sağlanır.
Jel elektroforezi, her biri farklı bir numune türüne uygun olan farklı jel tipleri ile gerçekleştirilebilir. Nükleik asitler genellikle bir agaroz jeli ile analiz edilir.

Agaroz Jel Elektroforezi Nasıl Çalışır?

Agaroz jel elektroforezi için önce, bir tür deniz yosunundan elde edilen doğal bir polisakkarit olan agaroz, iletken bir tamponda çözüldükten sonra bir jel tepsisine yayılması sağlanarak tepsiye dökülür. Örnek kuyuları oluşturmak için plastik bir tarak kullanın. Jel sertleştikten sonra tepsi iletken bir tampon solüsyonu ile dolu bir jel tankına yerleştirilir veya tampon solüsyonu jel tepsisine eklenir, nükleik asit numuneleri bir yükleme boyası ile karıştırılır ve numune kuyucuklarına pipetlenir. Nükleik asitlerin boyutunu bir moleküler ağırlık boyutu belirteci ile karşılaştırmak için, bu ilk kuyucuğa eklenir. Ardından jelin uzunluğu boyunca bir elektrik alanı uygulanır. Nükleik asitlerin omurgaları negatif yüklü olduğu için pozitif yüklü elektrota doğru geçecek ve boyutlarına göre ayrılacaklardır – nükleik asitler ne kadar büyükse o kadar yavaş yer değiştirirler. Jel çalıştırıldıktan sonra, jeli etidyum bromür gibi bir floresan enterkalasyon boyası ile boyayarak nükleik asitler görselleştirilir ve jel dokümantasyon sistemi ile bir görüntü yakalanır. Boyaya bağlı olarak, jeli dökmeden önce eklemeniz gerekebilir.

Agaroz Jel Elektroforezi İçin Gerekli Ekipmanlar ve Tampon Çözeltiler Nelerdir?

Agaroz jel elektroforezi gerçekleştirmek için bir jel elektroforez sistemine, harici bir güç kaynağına ve bir biyogüvenlik kabinine ihtiyaç vardır çünkü enterkalasyon ajanları tehlikelidir.

Agaroz jel elektroforezi için en yaygın iki tampon çözelti, TAE (Tris-asetat-EDTA) ve TBE’dir (Tris-borat-EDTA). İkisi arasındaki fark; TAE büyük nükleik asit segmentlerini (>15000 bp) ayırmada daha iyiyken TBE’nin daha küçük fragmanlar (<1000 bp) için çok uygun olmasıdır. TBE ayrıca uzun veya tekrarlanan çalışmalar için tercih edilmelidir çünkü daha iyi bir tamponlama kapasitesine sahip olduğu için aşırı ısınmaya daha az yatkındır.  Ancak borat bir enzim inhibitörü olduğundan, bantları geri kazanmak ve nükleik asitleri PCR gibi bir enzim içeren aşağı akış uygulamaları için kullanmak isteniyorsa TAE kullanmak gerekir. En önemlisi, farklı tampon çözeltilerin karıştırılmadığından emin olunmalıdır, örneğin jeli dökmek için TAE kullanıldıktan sonra tepsi TBA ile dolu bir tanka yerleştirilmemelidir.

Agaroz Jel Elektroforezi Kullanılarak Konsantrasyon ve Saflık Nasıl Belirlenir?

Agaroz jel elektroforezi kullanıldığında numunenin nükleik asit konsantrasyonu hakkında yalnızca nükleik asit bandının yoğunluğunun ilgili boyut işaretçisi bandıyla karşılaştırılmasıyla aşağı yukarı bir tahminde bulunabilir. Örneğin, jele 2 µl seyreltilmemiş DNA örneği yüklendiğinde ve bant aynı uzunluktaki 100 ng standarttaki bantla yaklaşık olarak aynı yoğunluğa sahipse, numune konsantrasyonu 50 ng/µl’dir. (100 ng 2 µl’ye bölünmüştür.)

Agaroz jel elektroforezi, numunelerin konsantrasyonunun aşağı yukarı bir tahminini vermenin yanı sıra nükleik asit ekstraksiyon protokollerinden sonra numune saflığını kontrol etmeye de yardımcı olur. Örneğin genomik DNA çıkardıysanız, numunelerinizin düşük moleküler ağırlıklı bir yayma olarak algılanabilecek RNA ile kontamine olup olmadığını görmek için bir jel çalıştırabilirsiniz.
Son derece hassas ve kontaminasyona açık oldukları için PCR reaksiyonlarından sonra bir jelin çalıştırılması da önerilir. Negatif ve pozitif kontrollerin beklenen sonuçları sağlayıp sağlamadığını kontrol etmek, master mix kontaminasyonlarını erken tespit etmeye ve ekstraksiyon protokolünün, reaktiflerin ve amplifikasyon adımlarının performansını doğrulamaya yardımcı olacaktır. Ayrıca, yalnızca tek bir bant elde edilip edilmediği doğrulanarak sadece ilgilenilen dizinin amplifiye edilip edilmediği görülebilir. Daha sonra bir boyut işaretçisi kullanılırsa amplifiye nükleik asit segmentlerinin beklenen boyuta sahip olduğu doğrulanabilir.

Spektrofotometri Nedir?

Spektrofotometri: Spektrofotometri, bir numune tarafından absorbe edilen (emilen) belirli bir dalga boyundaki ışığın oranını ölçer. Absorbans değerleri, örneğin, bir çözeltinin saflığını veya belirli bir analitin konsantrasyonunu belirleyerek hem kalitatif hem de kantitatif analizine izin verir.

Spektrofotometri Nasıl Çalışır?

Spektrofotometri kullanarak nükleik asit konsantrasyonunu ve saflığını ölçmek için bir mikrospektrofotometre veya mikro küvetlerle birlikte bir spektrofotometreyle çalışılabilir.

Mikrospektrofotometre kullanılıyorsa öncelikle alt kaide üzerine bir damla damlatıldıktan sonra kaide kolunu kapatarak, kısa bir süre bekleyip, kolu kaldırarak ve kaideleri kuru ve tüy bırakmayan laboratuvar havlusuyla silerek üst ve alt kaideleri distile su ile temizlemek gerekir.

Cihazı temizledikten sonra, alt kaide üzerine nükleik asidin içinde askıda kaldığı veya çözündüğü tampondan bir damla damlatılmalıdır. Mikrospektrofotometrenin kolu indirildiği anda sıvı, üst ve alt kaide arasında bir kolon oluşturacak ve yüzey gerilimi ile yerinde duracaktır. Spektral ölçümleri gerçekleştirmek için mikrospektrofotometre, bir ksenon flaş lambasından gelen ışığı üst kaideden sonra sıvının içinden ve entegre spektrometre tarafından algılandığı yer olan alt kaideden geçirir.

Tampon çözelti ile kör bir ölçüm yapılması, tamponun absorbansının etkisinin ortadan kaldırılmasını sağlar. Mikrospektrofotometre sıfırlandıktan sonra, numunelerin 230 nm, 260 nm ve 280 nm dalga boylarında absorbansı ölçülebilir. Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için numunelerin homojen ve iyi karıştırılmış olması gerekir. Ayrıca, bir sonraki numune eklenmeden önce hem üst hem de alt kaidelerden her bir numune silinerek kaidelerin temiz tutulduğundan emin olunmalıdır. INTEGRA, her 10 numuneden sonra bir kör ölçüm yapılmasını öneriyor. Absorbans tespit edilmediği takdirde sonraki 10 numune partisiyle devam edilir. Absorbans tespit edilirse kaideler saf su ile temizlenerek önceki numunelerdeki kalıntılar uzaklaştırılır.

Spektrofotometre ile çalışmak da çok benzerdir. Ancak kör ölçüm ve numuneleri alt kaide üzerine damlacık olarak pipetlemek yerine, bunları mikro küvetlere doldurup, absorbans ölçümlerini sizin için yapacak olan spektrofotometreye tek tek yerleştirmek gerekmektedir.

Spektrofotometri İçin Gerekli Ekipmanlar Nelerdir?

Az önce değinildiği gibi, ekipman olarak, mikro küvetlerle çalışan bir spektrofotometre veya bir mikrospektrofotometre kullanılabilir. Bir spektrofotometre daha hassas iken, bir mikrospektrofotometre 0,5 µl kadar düşük numune hacimleriyle çalışabilir. Birçok üretici, ikisini birleştiren cihazlar da sunar.

Spektrofotometri Kullanılarak Konsantrasyon ve Saflık Nasıl Belirlenir?

Spektrofotometreler ve mikrospektrofotometreler, aşağıdaki formülü kullanarak nükleik asit konsantrasyonunu hesaplar:

Konsantrasyon (µg/ml) = A260 Okuması x Çevirme Faktörü

Çevirme faktörü dsDNA için 50 µg/ml, RNA için 40 µg/ml ve ssDNA için 33 µg/ml’dir.

Not: Ölçümler yapılmadan önce konsantrasyonun seyreltme faktörüyle çarpılması gerektiği unutulmamalıdır.

Numunenin konsantrasyonu öğrenildikten sonra verimi aşağıdaki gibi hesaplanabilir; örn. PCR reaksiyonunun aşağı akış uygulaması için yeterli miktarda nükleik asit oluşturup oluşturmadığını belirlemek için:

Verim (µg) = Konsantrasyon x Toplam Numune Hacmi (ml)

Spektrofotometri, bir numunenin saflığını belirlemek için de kullanılabilir. Protein kontaminasyonunu (DNA örnekleri durumunda RNA kontaminasyonunu) tespit etmek için A260/A280 oranı ve kaotropik tuzlar, EDTA, iyonik olmayan deterjanlar, proteinler ve fenol ile kontaminasyonu tespit etmek için A260/A230 oranı hesaplanır. Saf dsDNA, 1.85-1.88’lik bir A260/A280 oranına ve saf RNA yaklaşık 2.1’lik bir A260/A280 oranına sahiptir. A260/A230 oranı genellikle A260/A280 oranından daha yüksektir ve tipik olarak dsDNA için 2.3-2.4 ve RNA için 2.1-2.3 arasındadır.

Florometri Nedir?

Florometri: Florometri, numuneyle ilgili analite bağlanan floroforlar ekleyip bunları bir UV ışını ile uyardıktan sonra yayılan dalga boyunu tespit edip ölçerek bir numunedeki analitleri tanımlamak ve ölçmek için kullanılan bir tekniktir. Numune floresansının bilinen standartlarla karşılaştırılmasıyla analitin miktarı belirlenebilir.

Florometri Nasıl Çalışır?

Spektrofotometrinin aksine, florometri bir deney kurulumu gerektirir. Bunun için numuneye uygun ve floresan boya, tampon ve standartlardan oluşan bir test kiti edinmek gerekmektedir. Numuneleri hazırlarken, floresan boyanın nükleik asitler ve standartlara bağlandığından emin olmak için kit üreticisinin talimatları izlenmelidir. En yaygın floresan boyalara genel bir bakış aşağıdaki tabloda bulunabilir. Daha sonra florometrenin ölçümlerini olumsuz etkileyebileceğinden, pipetleme ve karıştırma adımları sırasında hava kabarcıklarının oluşmasını önlemenin önemli olduğu unutulmamalıdır.

                                     Boya:
Üretici:                         dsDNA                            ssDNA                            RNA
Thermo Scientific^TM     PicoGreen^TM                  OliGreen^TM                     RiboGreen^TM
Promega                      QuantiFluor® dsDNA      QuantiFluor® ssDNA      QuantiFluor® RNA
InvitrogenTM                Qubit dsDNA testi           Qubit ssDNA testi           Qubit RNA testi
(QubitTM)

Florometrede ölçümlere başlamadan önce, PCR tüplerini standartlarla okuyarak cihazı kalibre etmek gerekir. İlk standart 0 ng/ml’lik bir konsantrasyonu ve sonuncusu test aralığının maksimum konsantrasyonunu göstermelidir. Standart eğri oluşturarak florometreyi kalibre ettikten sonra numuneleri içeren PCR tüpleri arka arkaya eklenebilir.

Florometri için Gerekli Ekipmanlar Nelerdir?

Yukarıdaki bölümde açıklandığı gibi, floresan ölçümleri yapmak için bir florometreye ve bir test kitine ihtiyaç vardır. Analiz edilecek çok sayıda numune varsa, entegre bir PC ile floresan ölçümü yapabilen bir mikroplaka okuyucu da kullanılabilir. Test kurulumundaki fark, numune ve standartların PCR tüpleri yerine bir mikro plakaya eklendikten sonra tek seferde tüm plakanın floresansının ölçülebilmesidir.

Florometri Kullanılarak Konsantrasyon Nasıl Belirlenir?

Florometreler genellikle nükleik asit konsantrasyonunu hesaplar. Florometrenin hesaplama fonksiyonu yoksa numunenin floresansı standart eğriyle karşılaştırarak nükleik asit konsantrasyonu hesaplanabilir. Spektrofotometride ise elde edilen konsantrasyonu seyreltme faktörü ile çarpmak ve konsantrasyonu toplam numune hacmi ile çarparak verimi hesaplamak unutulmamalıdır.

Nükleik asitlerin saflığı florometri ile hesaplanamaz. Çünkü florometri yalnızca nükleik asitlere bağlı floroforları tespit ettiği için kirleticileri belirleyemez.

Spektrofotometri ve Florometri Kıyaslaması

Az önce açıklandığı gibi, florometreler nükleik asit örneklerinin saflığını ölçemez, sadece konsantrasyonlarını ölçebilir. Spektrofotometriye kıyasla bir başka dezavantajı, pahalı test kitleri nedeniyle daha maliyetli olması ve analizden önce numunelerin floresan boya ile karıştırılması gerektiği için daha fazla zaman almasıdır.

Florometrinin spektrofotometriye göre avantajları, çok daha hassas olması ve seyreltilmiş numunelerle daha iyi sonuçlar vermesidir, örn. nükleik asit ekstraksiyonundan sonra. Mesela NanoDrop^TM spektrofotometrenin alt tespit limiti 0,4 ng/µl iken Qubit florometrenin alt tespit limiti 0,005 ng/µl’dir. Bunun da ötesinde, florometreler, proteinler gibi diğer numune bileşenlerinin absorbansını tespit etmedikleri için nükleik asit konsantrasyonunu olduğundan fazla tahmin etmezler. Florometrinin bir başka avantajı da tek seferde tüm bir mikro plakayı analiz edebilen mikro plaka okuyucuları kullanabilmek ve böylece verimi önemli ölçüde artırabilmektir.

PCR’den sonra, zaten çok yüksek sayıda ilgilenilen nükleik asit segmentine (amplikon) sahip olunduğu için konsantrasyonun hassasiyeti ve fazla tahmin edilmesi genellikle bir sorun değildir. Bu, konsantrasyonun çok kesin bir şekilde belirlenmesi gerekmedikçe, örneğin aşağı akış uygulamanız Yeni Nesil Dizileme (Next Generation Sequencing – NGS) ise, bir PCR reaksiyonundan sonra spektrofotometrinin tercih edilen yöntem olduğu anlamına gelir. NGS testleri için, tek seferde analiz etmek üzere 96 adede kadar numunenin bir araya getirilebilmesi ve istenen sonuçları elde etmek için bu numunelerin tam olarak aynı konsantrasyona sahip olması gerekliliği florometriyi ideal yöntem haline getirir.

Bir NGS testi için numune toplarken tüm numunelerde aynı nükleik asit konsantrasyonuna sahip olmak çok kritik olduğundan, örneğin Agilent’in TapeStation sistemi ile florometri sonuçları iki kez kontrol etmek istenebilir. Bu sistem, jel elektroforezine benzer şekilde çalışır ancak tam otomatiktir. Numuneleri, uçları ve ScreenTape’i (elektrotlar, jel matrisi ve numune türüne uygun bir tampon içeren küçük bir kaset) yerleştirdikten sonra, 16 numuneye kadar otomatik olarak analiz edebilir ve bir jel görüntüsü ve her numune için bir konsantrasyon ölçümü sağlar.

INTEGRA Laboratuvarında Hangi Ekipmanlar Kullanılıyor?

INTEGRA, yakın zamanda kurduğu kendi PCR laboratuvarına nükleik asitlerin görselleştirilmesi için bir jel elektroforez sistemi ve ek kalite kontrol ve konsantrasyon ölçümleri için kullandığı bir mikrospektrofotometre satın aldı. Spektrofotometri genellikle aşağı akış uygulamaları için yeterince hassas olduğundan, bir florometre satın almadı. Yine de bir NGS testi yapmaları gerekirse, bir test kiti satın alıp floresan ölçümlerini zaten sahip oldukları bir mikro plaka okuyucuda yapabilirler.

Sonuç

Nükleik asit ekstraksiyon protokollerinin ve PCR reaksiyonlarının başarısını kontrol etmek ve nükleik asit numunelerinin saflığını ve konsantrasyonunu belirlemek için genellikle bir metot kombinasyonu kullanmak gerekir. Jel elektroforezi ve spektrofotometri çoğu numune ve uygulama için uygundur, ancak seyreltilmiş numunelerle çalışılıyorsa veya NGS gibi aşağı akış uygulamaları için son derece hassas konsantrasyon ölçümlerine ihtiyaç varsa, bir florometre de gerekebilir ve hatta sonuçları iki kere kontrol etmek için bir TapeStation edinmek de düşünülebilir.

Bu blog yazısının nükleik asit görselleştirme ve miktarının belirlenmesi ile ilgili tüm sorularınızı yanıtladığını umuyoruz. Peki ya numunelerinizin yeterince saf olmadığı ortaya çıkarsa? Bunun cevabını öğrenmek için nükleik asit saflaştırma hakkındaki blog yazımızı okuyabilirsiniz.

Kaynak: https://www.integra-biosciences.com/global/en/blog/article/determine-concentration-and-purity-nucleic-acids