Nanoemülsiyon Adjuvanlarının Terminal Sterilizasyonuna Çözüm

Nanoemülsiyonların ilaç dağıtım sistemleri olarak önemli faydalar sağladığı kanıtlanmıştır. Biyolojik olarak parçalanabilen su içinde yağ emülsiyonları, tolere edilebilirliği artırdıkları ve ek bir bağışıklık uyarıcısına ihtiyaç duymadan artan bağışıklık yanıtı gösterdikleri için etkili aşı adjuvanları olarak ortaya çıkmıştır.

Adjuvanlı aşıların çoğu hastaya enjeksiyon olarak uygulanır. Bu da sterilizasyonun kritik bir adım haline geldiği anlamına gelmektedir. Isıya dayanıklı maddeler içeren sistemler için, ısı kullanarak terminal sterilizasyon her zaman uygun bir seçenek değildir, bu nedenle bunun yerine steril filtrasyon kullanılır.

Steril filtrasyon adımının doğrulanması zor olabilir ve birleşik proses geliştirme ve filtrasyon teknolojisi ile sağlam bir çözüm gerektirir. İlk olarak steril filtrasyon, ürünü 0,22 µm dereceli sterilizasyon sınıfı filtrelerden geçirerek yapılır. Mevcut 220 nm’den büyük partiküller filtre veriminde önemli bir düşüşe neden olabilir veya sonunda filtreleri tıkayabilir. Bu nedenle, üretim sürecinin sadece küçük partikül boyutuna değil aynı zamanda dar partikül boyutu dağılımlarına sahip adjuvan nanoemülsiyonlar üretmesi gerekir. İkinci olarak, üretim süreçleri ve çevre sırasında ortaya çıkan çeşitli kontaminasyon kaynakları, steril filtrasyon adımı için ek zorluklar yaratabilir. Son olarak, adjuvan nanoemülsiyonların doğası, bakteriyel tutma etkinliğini azaltma ve ürün sterilitesini kaybetme potansiyeli ile onları yüksek riskli sıvılar haline getirir.

 

Bu blog yazısında, nanoemülsiyon bazlı bir adjuvanın üretim yöntemini ve başarılı steril filtrasyon sürecini göstereceğiz.

Steril Filtrasyon

Bir ürün aseptik bir ortamda işlenmiyorsa (ki bu pahalı ve bakımı zor olabilir), bakteriler de dahil olmak üzere kirleticiler çeşitli dış kaynaklardan, üretim sürecinden veya bakım sırasında ortaya çıkabilir.

Bununla mücadele etmek için, sterilizasyon sınıfı filtreler hem uzaklaştırma hem de tutma mekanizmaları yoluyla bu kirleticileri atmak için kullanılabilir. ABD FDA’nın 2004 yılında yayımlanan Aseptik İşlemle Üretilen Steril İlaç Ürünleri Kılavuzuna göre, sterilizasyon sınıfı filtre, “Uygun şekilde onaylandığında, bir sıvı akışından tüm mikroorganizmaları uzaklaştırarak steril bir çıkış suyu üreten bir filtre” olarak tanımlanmıştır [ref 1]. Bu filtreler tipik olarak 0,22 µm civarında bir ortalama gözenek çapına sahiptir. Bu filtreler 0,22 µm gözenek boyutuna sahip olacak şekilde derecelendirilmiş olsa da, gerçek membranın 0,22 µm’den çok daha büyük birçok gözenek açıklığına sahip olabileceğine dikkat etmek önemlidir, bu da bakterilerin membran derinliğine belirli bir mesafeye nüfuz etmesine izin verir.

Aynı kılavuz, sterilizasyon filtrelerinin doğrulanmasının “filtrelenecek malzeme için en kötü durum üretim koşullarını simüle etmek için mikrobiyolojik zorlukları ve çalışma için kullanılan filtrelerin bütünlük testi sonuçlarını içermesi gerektiğini” de belirtmektedir. Yaygın olarak kullanılan bir mikroorganizma Brevundimonas diminuta’dır ve genellikle etkili filtrasyon alanının cm2’si başına en az 107 CFU’luk bir zorluk konsantrasyonu kullanılmalıdır. Emülsiyonlarda tutarlı bakteri azaltımı ve ardından bakteri tutma çalışmaları elde edilmesine yardımcı olmak için genellikle ön filtreleme de gereklidir.

Microfluidizer® Teknolojisi

Microfluidizer® işlemciler, çok fazlı akışkanları sabit geometrili bir ReactionChamberTM içinde bulunan mikrokanallardan pompalamak için yüksek basınç kullanır. Yüksek basınçlarda, mikrokanal içindeki akışkan hızı 400 m/s’nin üzerine çıkabilir ve bu da 108 s-1’e kadar kayma hızlarına neden olur. Bu yüksek kayma hızları ve ardından gelen türbülanslı enerji dağılımları tarafından üretilen yoğun mikro-karıştırma, partikül/damlacık boyutunu önemli ölçüde ve verimli bir şekilde azaltabilir. Sadece istenen partikül boyutu elde edilmekle kalmaz, aynı zamanda üretilen partikül boyutu dağılımı da çok dardır.

Aşağıda gösterildiği gibi, Microfluidizer® teknolojisini kullanırken ölçek büyütmek oldukça basittir. Laboratuvar ölçekli üniteler tek mikrokanallı Interaction Chambers™ kullanırken, üretim ölçekli üniteler bu mikrokanalları paralel olarak yerleştirir, bu da daha yüksek bir verim sağlar ve aynı zamanda tüm malzeme hala aynı kesme seviyelerine maruz kalır, böylece ölçek büyütme sonuçlarını garanti eder.

Metodoloji

Bu vaka çalışmasında, bir Microfluidizer® işlemci kullanılarak bir aşı adjuvanı oluşturulmuş ve bu adjuvan daha sonra Pall Life Sciences tarafından üretilen sterilizasyon sınıfı filtrelerden geçirilmiştir. Tüm süreç aşağıdaki şemada gösterilmiştir [Ref 2]. Model adjuvan emülsiyonu skualan yağı ile formüle edilmiştir. Bu formülasyon, farklı partikül boyutu özelliklerine sahip nanoemülsiyonlar oluşturmak için pilot ölçekli bir Microfluidizer® işlemci aracılığıyla çeşitli koşullar altında işlenmiştir. Nanoemülsiyonlar önce Pall Supor® EKV filtre ile ön filtreden geçirilmiş ve ardından her ikisi de sterilizasyon sınıfı filtreler olan Pall Fluorodyne® EX EDF filtreden geçirilmiştir. Steril çıkış suyu daha sonra proses validasyonu için yukarıda bahsedilen bakteriyel tutma çalışmasına göre sorgulanmıştır.

Sonuçlar

Aşı Adjuvanı Nanoemülsiyon Üretimi

Tüm farklı nanoemülsiyon modelleri (farklı işleme koşullarının bir sonucu olarak çeşitli parçacık boyutu özellikleriyle oluşturulan) izlenmiş ve sonuçlar aşağıda verilmiştir:

Partikül boyutu ölçümleri, Microfluidizer® işlemcinin sadece küçük damlacık boyutlarına sahip nanoemülsiyonlar oluşturmada çok verimli olmadığını, aynı zamanda hem spesifik hem de farklı ortalama partikül boyutlarına sahip nanoemülsiyonlar gibi istenen sonuçları elde etmek için kolayca ayarlanabileceğini göstermiştir. Tüm testler, yaklaşık 110 nm ila 170 nm arasında değişen 200 nm’nin (veya 0,2 µm) oldukça altında bir d50 partikül boyutu elde edebilmiştir. d95 ölçümleri 180 nm ila 300 nm arasında değişmektedir. Oluşturulan tüm nanoemülsiyon örnekleri çok sıkı partikül boyutu dağılımlarına sahipti.

Steril Filtrasyon

d50 partikül boyutları 155 nm (Örnek A), 134 nm (Örnek B) ve 124 nm (Örnek D) olan nanoemülsiyonlar Pall Fluorodyne EX EDF filtresinden geçirilmiştir. Her bir numune için elde edilen verim aşağıda gösterilmiştir:

Her bir numunenin d50 partikül boyutu, 0,22 µm’lik bir filtreden geçirilebileceklerini gösterse de, gözlemlenen gerçek verim ve elde edilen akı sonuçları bu nanoemülsiyon numuneleri arasında büyük farklılıklar göstermiştir. D50 partikül boyutu 124 nm olan nanoemülsiyon, d50 partikül boyutu 134 nm ve 155 nm olan biraz daha büyük nanoemülsiyonlardan çok daha hızlı bir şekilde filtreden geçirilebilmiş, dolayısıyla çok daha yüksek verim elde edilmiştir – d50’si 124 nm ve 155 nm olan nanoemülsiyonlar karşılaştırıldığında neredeyse 20 kat daha yüksek verim elde edilmiştir. Bu durum, ‘doğru’ aralıkta bir d50 partikül boyutuna sahip olunmasına rağmen, numuneleri steril bir filtreden verimli bir şekilde geçirmeye çalışırken tüm partikül boyutu dağılımının dikkate alınması gerektiğini kanıtlamıştır. Bu vaka çalışmasındaki daha yüksek çıktılar, daha düşük d95 değerleriyle doğrudan ilişkilidir; bu da ürünleri verimli bir şekilde sterilize etmek için küçük, sıkı partikül boyutu dağılımlarının istendiğini göstermektedir.

Gerçekte küçük, sıkı partikül boyutu dağılımları filtrelere harcanan miktardan büyük tasarruf anlamına gelebilir. Daha büyük partiküllerin sayısının daha az olması, daha az partikülün membran gözeneklerine takılacağı ve böylece hem verimin artacağı hem de tıkanan filtre miktarının azalacağı anlamına gelir. Sonuç olarak, aynı miktarda ürünü işlemek için çok daha küçük bir filtre alanı veya daha az sayıda filtre gerekebilir. Bu partikül boyutu sonuçları, bir Microfluidizer® işlemci kullanılırken ReactionChamberTM, basınç ve geçiş sayısı dahil olmak üzere doğru işleme koşulları hassas bir şekilde seçilerek elde edilebilir.

Çalışmada ayrıca 124 nm d50 partikül boyutuna sahip bir nanoemülsiyon örneği için hem filtrasyon öncesi hem de sonrası (çeşitli basınçlar altında filtrelenirken) partikül boyutu ölçülmüştür. Aşağıdaki şekilde gösterildiği gibi, ne filtreleme işlemi ne de seçilen filtre membran malzemeleri partikül boyutunu etkilemiştir. d10, d50 ve d90 partikül boyutları, 30 psi (kırmızı çubuklar) veya 60 psi’de (yeşil çubuklar) filtrelendiğinde filtreleme öncesi boyutlarından (mavi çubuklar) esasen değişmeden kalmıştır. Bu da nanoemülsiyonun bütünlüğünün önemli ölçüde değişmediğini göstermektedir.

Bakteriyel Zorlama Testi

Bakteriyel zorlama testi için 124 nm d50 partikül boyutuna sahip nanoemülsiyon ve EDF filtreleri seçilmiştir. Bu, nanoemülsiyonun veya proses koşullarının test organizmasını veya filtre membranını etkileyip etkilemediğini belirlemek için önemli bir doğrulama adımıdır, bu da test organizmasının tutulamamasına neden olur. Sonuçlar aşağıdaki tabloda gösterilmektedir. Tüm filtreler, test edilen tüm filtrasyon basınçlarında tam bakteri tutma, yani çıkış suyunda sıfır bakteri olduğunu göstermiştir. Bu da hem adjuvan nanoemülsiyonların ve bunların üretim sürecinin hem de steril filtrasyon sürecinin başarıyla doğrulandığını göstermektedir.

Özet

Özetlemek gerekirse, araştırma nanoemülsiyon partikül boyutu ve dağılımlarının Microfluidizer® işlemci üzerindeki işleme parametrelerinin ayarlanmasıyla hassas bir şekilde kontrol edilebileceğini göstermiştir. Bu hassas boyutlar ve dağılımlar, steril sınıf bir filtreden verim kaybı veya filtreleme kabiliyeti olmadan verimli bir şekilde işlemeyi sağlamak için gereklidir.

Ayrıca, etkili bir steril filtre partikül boyutunu büyük ölçüde etkilememelidir, yani filtreye koyduğunuz ürün, filtreden çıkardığınız ürünle esasen aynı olmalıdır – böylece ürün kalitesi sağlanır.

Kaynak: https://www.microfluidics-mpt.com/blog/solution-to-terminal-sterilization-of-nanoemulsion-adjuvants