Assist Plus’la Lonza PyroGene® Rekombinant Faktör C analizinde endotoksin saptama testinin otomasyonu

Otomatik bakteriyel endotoksin testi

Lonza PyroGene® Rekombinant Faktör C Analizinde (rFC) Endotoksin Saptama Testi, insan ve hayvan parenteral farmasötiklerinde ve tıbbi cihazlarda bakteriyel endotoksin kontaminasyonunu taramak için yaygın olarak kullanılan geleneksel limulus amebosit lizat (LAL) testine bir alternatiftir. rFC testi hem yüksek hem de düşük verimli laboratuvarlarda kullanılır ve LAL testinin aksine at nalı yengeci kanından elde edilmez. Testin ayarlanması, sağlanan endotoksin stok çözeltisinden 10 kat seyreltilmiş standartların manuel olarak hazırlanmasını gerektirir. Standartlar ve numuneler, 96 hazneli bir plakaya çift haznelik olarak eklenir. Ürün inhibisyonunu kontrol etmek için bilinen bir endotoksin konsantrasyonu, eklenmiş numuneler olan pozitif ürün kontrolleri (PPC’ler) numunelerinin yanındadır. Standartların, numunelerin ve PPC’lerin ilk kaplanmasının ardından, kullanıcının florojenik substrat, tahlil tamponu ve rFC enziminden oluşan bir çalışma solüsyonu hazırladığı 10 dakikalık bir ön inkübasyon gerçekleştirilir.

Bu uygulama notu, standartların, numunelerin, PPC numunelerinin, boşlukların hazırlanmasının ve bunların 96 hazneli plakaya eklenmesinin, D-One tek kanallı pipetleme modülü kullanılarak Assist Plus pipetleme robotunda kolaylıkla otomatikleştirilebileceğini göstermektedir. Daha sonra çalışma reaktifinin eklenmesi Voyager araklıları ayarlanabilir çok kanallı pipet kullanılarak tamamlanır. Tüm pipetleme adımlarının otomasyonu, pipetleme hataları olasılığını azaltır ve sağlam tekrarlanabilirlik sağlar. Bu analizdeki temel kalite göstergeleri, standart eğrinin korelasyon katsayısı ve numune varyasyon katsayısıdır (CV).

İpuçları

• Standart dilüsyonların otomatik olarak hazırlanması, tüm çalışmalardan daha performanslı olacak ve pipetleme hatalarını ortadan kaldıracaktır.
• Hatasız pipetleme, numunelerin sıkı CV değerleri ile tekrarlanmasını sağlayarak testin tekrarlanma olasılığını azaltır.
• Kullanıcılar, D-One tek kanallı pipetleme modülünü esnek ve programlaması kolay Assit Plus ile birlikte kullanarak tam plakaların veya kısmi plakaların testini gerçekleştirebilir.
• Ekrandaki uyarılar, kullanıcıyı cihaz kurulumu boyunca yönlendirir.

Genel Bakış: PyroGene® rFC endotoksin tespit testi nasıl yapılır?

PyroGene® Rekombinant Faktör C (rFC) Endotoksin Saptama Testi, endotoksin değerlerini ölçmek için bir floresan mikroplaka okuyucu – WinKQCL® Endotoksin Saptama Analizi Yazılımı ile eşleştirilmiş PyroWave® XM Okuyucu – gerektiren florojenik bir testtir. Plaka kurulmadan önce WinKQCL® Yazılımında bir şablon hazırlanır. Şekil 1, Assit Plus tarafından plaklanan numunelerle kullanılmak üzere geliştirilmiş WinKQCL® Yazılımı şablonunu göstermektedir. Bu şablon, 21 adede kadar numunenin eşleştirilmiş PPC numuneleri ile bir plaka üzerinde çift olarak test edilmesini sağlar. Kullanım talimatlarında yazıldığı gibi, plakaya RFC çalışma solüsyonu iletmek için 8 kanallı çok kanallı bir pipetin kullanımına izin verirken, değişen sayıda numune için en fazla esnekliği sağlamak üzere tasarlanmıştır.

Şekil 1: WinKQCL® Yazılımındaki Lonza rFC şablonu. Kırmızı hazneler: standartların konumu; Mavi hazneler: iki kopya hâlinde test edilen numuneler; Sarı hazneler: PPC eklenmiş numuneler iki kopya hâlinde test edilmiştir. A3 ve A4 kuyuları boş.

D-One 5-300 µl tek kanallı pipetleme modülü ilk olarak standart dilüsyonları hazırlamak için kullanılır. Standartların hazırlanmasının ardından, tekrar dağıtım modunda 96 hazneli plakanın belirlenen haznelerine PPC eklenir. Daha sonra, yukarıdaki şablona göre plakaya standartlar ve numuneler eklenir. Standartlar ve numuneler, hem temiz hem de PPC çivili haznelere eklenen numunelerle iki kopya hâlinde plakaya eklenir. Tüm numuneler eklendikten sonra, plaka 37 °C’de 10 dakika ön inkübe edilir. İnkübasyon sırasında kullanıcı çalışma reaktifini Integra 10 ml SureFlo™ reaktif rezervuarında hazırlar. 10 dakikalık ön inkübasyonun sonunda çalışma reaktifi, Assist Plus’un üzerinde bir VOYAGER 8 kanallı 300 µl pipet kullanılarak plakaya eklenir.

İpuçları

• Doğru sonuçlar elde etmek için pirojen içermeyen sertifikalı GRIPTIPS®’i SureFlo rezervuarlarıyla birlikte kullanın.
• LONG 300 µl GRIPTIPS®, 13 x 100 mm Lonza pirojen içermeyen test tüplerinde 1 ml’nin altındaki numune hacimlerine ulaşabilir ve asla sızıntı yapmaz veya düşmez.
• PPC ve numuneler, zamandan ve maliyetten tasarruf etmek için tekrar dağıtım modu kullanılarak dağıtılır.
• WinKQCL® Yazılımı şablonundaki boş test, standartların ve numunelerin plaka yerleşimi, tam veya kısmi plakaları çalıştırmak için en fazla esnekliği sunmak üzere tasarlanmıştır.

Deney Hazırlığı

A pozisyonu: LAL su – 10 ml çok kanallı reaktif haznesi

B pozisyonu: PyroGene® rFC analiz plakası – 96 hazneli düz tabanlı plaka (Corning)

C pozisyonu: Standartlar, numuneler ve PPC – Integra tüp rakı

Şekil 2: PyroGene® Analiz plakası formatı için Assist Plus kurulumu. Konum A: 10 ml SureFlo rezervuarında LAL suyu. Konum B: 96 hazneli tahlil plakası. Konum C: Lonza pirojen içermeyen tüpler (boş, macenta), 250 µl 20 EU/ml endotoksin standardı (yeşil) ve 1 ml numune (mavi) içeren tüp rakı.

1. PyroGene® rFC analiz plakası kurulumu

Standartlar, numuneler ve PPC eklenmiş numuneler plakaya eklenir.

D-One 0,5-300 µl tek kanallı pipetleme modülünü Assist Plus pipetleme robotuyla eşleştirin. 1 ml numune içeren pirojensiz test tüplerini C pozisyonunda ki tüp rakına yerleştirin (Şekil 2’de ki mavi tüpler). Rakın içindeki A1-A3 konumlarına üç boş tüp yerleştirin. Bunlar, standart dilüsyonları oluşturmak için kullanılır (Şekil 2’de ki eflatun tüpler). Rakta A4’te 20 EU/ml endotoksin standardından 250 ul içeren bir tüp yerleştirin (Şekil 2’deki yeşil tüp). LAL suyu tutan 10 ml SureFlo rezervuarını pozisyon A’ya ve 96 hazneli bir floresan plakayı pozisyon B’ye yerleştirin.

‘Lonza PyroGene® Analiz plakası kurulumu’ programı başlatıldığında, pipet önce üç boş seyreltme tüpünün her birine 900 µl LAL suyu dağıtır (Şekil 3). Daha sonra, 750 µl LAL suyu, 250 µl 20 EU/ml endotoksin standardını tutan tüpe dağıtılarak 5 EU/ml standardı oluşturulur. Paket ekleme talimatlarının ardından, pipet üzerindeki bir mesaj, kullanıcıya 5 EU/ml standardını 1 dakika boyunca vorteksleme talimatı verir. Assist Plus, kullanıcının bu adımı gerçekleştirmesi için duraklar ve kullanıcı mesajı onayladığında yeniden başlar. Bir sonraki standart, 100 µl 5 EU/ml standardının 900 µl LAL su tutan bitişik tüpe aktarılması ve ardından vorteksleme ile oluşturulmasıdır. Kalan iki standart benzer şekilde oluşturulur.

Şekil 3: LAL suyu, D-One tek kanallı modül tarafından dağıtılır.

Tüm standartlar oluşturulduktan sonra, 5 EU/ml standardından 10 µl, PPC olarak belirlenen plakanın her bir haznesine eklenir (Şekil 4). Bu, endotoksin tespitinin örnek inhibisyonunu izlemek için bir kontrol görevi görür. Her boş test, standart ve numune daha sonra iki kopya hâlinde uygun haznelere eklenir. Yinelenen numuneler ayrıca PPC haznelerine eklenerek 0,5 EU/ml PPC eklenmiş numuneler oluşturulur. Tüm standartlar ve numuneler plakaya eklendiğinde, plaka 37 °C’de 10 dakika ön inkübe edilir.

Şekil 4: PPC, D-One tek kanallı pipetleme modülü tarafından eklenir.

2. PyroGene® analiz reaktifi ilavesi

Plakanın her haznesine 100 µl çalışma reaktifi ekleyin.

Plaka ön inkübasyon yaparken, florojenik substrat, rFC tahlil tamponu ve rFC enzim solüsyonunu 5:4:1 oranında birleştirerek 10 ml SureFlo rezervuarında çalışma reaktifini manuel olarak hazırlayın. Çalışma reaktifini pozisyon A’da temiz bir 10 ml SureFlo rezervuarına yerleştirin (Şekil 5). 300 µl 8 kanallı Voyager pipetini Assist Plus ile eşleştirin ve D-One uç yuvasını standart uç katıyla değiştirin. 10 dakikalık ön inkübasyonun sonunda plakayı pozisyon B’ye yerleştirin. Plakanın her bir haznesine 100 µl reaktif eklemek için Vialab programı ‘Lonza PyroGene® Analiz reaktifi ilavesi’ni başlatın. Reaktif ekleme işlemi tamamlandığında, testi tamamlamak için plakayı floresan mikroplaka okuyucusuna yerleştirin.

Şekil 5: Assist Plus’un reaktif ilavesi için plaka kurulumu. Pozisyon A: 10 ml SureFlo rezervuarında çalışan endotoksin reaktifi. Pozisyon B: Önceden inkübe edilmiş standartları ve numuneleri içeren 96 hazneli plaka.

İpuçları

• Vialab programları, laboratuvarlara mevcut ve gelecekteki test taleplerini karşılamak için tam bir esneklik sağlayarak, farklı sayıda numuneyi barındıracak şekilde uyarlanabilir.
• LONG 300 µl GRIPTIPS®, bu testin tüm adımlarında müşterilerin satın alma sürecini basitleştirerek kullanılır.

Analiz Verifikasyonu

21 numune ve standarttan oluşan üç çalışma, Assist Plus’un üzerinde ayarlandı ve PyroGene® rFC Analiz talimatlarına göre test edildi. Numuneler, bilinen konsantrasyonlarda endotoksin standardı eklenmiş LAL suyundan oluşuyordu. Plaka başına 6 kez çalıştırılan 0 EU/ml numune dışında, her plaka üzerinde her konsantrasyonda 5 numune çalışılmıştır. Veri analizi, WinKQCL® Yazılımı kullanılarak yapıldı. Tablo 1 standartların ve numunelerin konsantrasyonlarını göstermektedir.

Tablo 1: Standartların ve eklenmiş numunelerin endotoksin konsantrasyonları.

Standardlar [EU/ml]	Endotoksin eklenmiş LAL suyu örnekleri [EU/ml]
5	2.5
0.5	0.25
0.05	0.025
0.005	0

Sonuçlar

Sonuçlar Tablo 2-4’te gösterilmektedir. Tüm çalışmalar için standart eğri, doğrusallık gösterdi ve tüm eğriler, kullanım talimatlarında tanımlanan kalite parametreleri içindeydi (Tablo 2). Her bir endotoksin konsantrasyonunun eklendiği numuneler tespit edildi (Şekil 6). İlaç ve tıbbi cihazlarda kabul edilebilir endotoksin konsantrasyonları için eşik değer olan <0,005 EU/ml’de çivilenmemiş tüm numuneler tespit edilemez durumda kaldı. Standartların, numunelerin ve PPC numunelerinin tüm kopyaları, %25’in altında kabul edilebilir sınır içinde bir CV sergiledi (Tablo 3).

Tablo 2: 1-3 çalıştırmaları için kalite spesifikasyonları ile standart eğri sonuçları.

	Korelasyon katsayısı (0.980-1.000)	Eğri (0.760-1.110)	Y-keseni (2.500-5.000)
Çalışma 1	1.000	0.930	4.112
Çalışma 2	0.999	0.903	4.258
Çalışma 3	0.998	0.909	4.267

Şekil 6: 2,5, 0,25 ve 0,025 EU/ml endotoksin konsantrasyonlarında eklenen numuneler için sonuçların dağılımı.

Tablo 3: Eşleştirilmiş numuneler ve PPC numuneleri için plaka başına ortalama varyasyon katsayısı.

	Ortalama eşleştirilmiş örnek %CV	Ortalama PPC %CV	QC başarısızlığı, plaka başına %CV
Çalışma 1	4.19	4.37	0
Çalışma 2	1.84	4.03	0
Çalışma 3	3.66	3.87	0
Genel Ortalama	3.23	4.09	0

Notlar

• Kısmi plaklar: Temin edilen Vialab programları, kısmi plaklar için veya numuneleri üç kopya hâlinde çalıştırmak için uyarlanabilir.
• Çalıştırma raporu: Assist Plus pipetleme robotu bilgisayara bağlıysa, Vialab programları doğrudan bilgisayardan başlatılabilir. Çalıştırmadan sonra, başlangıç ​​ve bitiş saatleri, kullanıcı kimliği, hesaplanan hacimler ve meydana gelen hatalar gibi ayrıntıları belgeleyen bir rapor otomatik olarak oluşturulur. Bu, düzenleyici gereklilikleri yerine getirmek için uygun bir yol sunar.

Sonuç

• ASSIST PLUS, Lonza PyroGene® rFC Endotoksin Tespit Testinin düşük ila orta verimli kullanıcıları için uygun maliyetli, kullanımı kolay bir otomasyon çözümü sunar.
• VIALAB yazılımının kolaylığı ve esnekliği, kullanıcıların bu uygulama notunda tanımlanan laboratuvar gereçlerinin aynısını kullanarak plaka düzenlerini özelleştirmelerine veya kısmi plakalar oluşturmalarına olanak tanır.
• ASSIST PLUS ile yüksek kaliteli, tekrarlanabilir sonuçlar elde edilebilir, bu da maliyetli ve zaman alıcı yeniden test riskini ortadan kaldırır.

Kaynak:https://www.integra-biosciences.com/global/en/applications/automated-set-lonza-pyrogener-recombinant-factor-c-assay-endotoxin-detection-test-assist-plus