Nükleik Asit Ekstraksiyonu İçin Gerekli Ekipmanlar Nelerdir?

Nükleik Asit Ekstraksiyonu Nedir?

İlk nükleik asit ekstraksiyonu 1869’da hücrelerin kimyasal bileşimini belirlemeye çalışırken lökositlerden DNA izole eden İsviçreli doktor Friedrich Miescher tarafından gerçekleştirildi. O zamandan beri, nükleik asit ekstraksiyonu üzerine kapsamlı çalışmalar yapılarak geliştirildi ve aşağıdaki tanım ortaya çıktı:

Nükleik Asit Ekstraksiyonu: Kan, kültür hücreleri, mikroplar, toprak veya bitki ve hayvan dokuları gibi numunelerden DNA, RNA veya toplam nükleik asitleri çıkarmak (ekstraksiyon) için numuneler, numuneye ve sonraki uygulamaya bağlı olarak değişen bir dizi işleme tabi tutulur. Bu işlemler, hücre lizizi, nükleazların inaktivasyonu ve istenen nükleik asidi hücresel kalıntılardan ayırmak için saflaştırmayı içerir.

NAE (Nükleik Asit Ekstraksiyonu) Metotları ve Ekipmanı

Aşağı akış (downstream) uygulamaları için yeterli miktarda ve yüksek kaliteli saflaştırılmış nükleik asit elde etmek adına numune türü için en iyi saflaştırma metodunu (veya metot kombinasyonunu) bulmak gerekir. Bu bölüm en yaygın metotlara genel bir bakış sunup nasıl çalıştıklarını açıklıyor ve avantajlarını ve dezavantajlarını tartışıyor. Ayrıca hangi metot için ne tür bir ekipmana ihtiyaç olduğu ve INTEGRA’nın kendi laboratuvarında nelerin yapıldığı da anlatılıyor.

Ama önce, son 150 yılda geliştirilen iki nükleik asit ekstraksiyon yöntemine bir göz atalım ve hızlı ve kolayca gerçekleştirilmelerine rağmen neden artık kullanılmamaları gerektiğinden bahsedelim.

Geleneksel NAE Metotları

Hızlı tek adımlı ekstraksiyon

Adından da anlaşılacağı gibi, bu yöntem yalnızca bir adımdan oluşur. Numuneye Tris-HCl, EDTA, sodyum lauril sarkosil ve suda çözünmeyen PVPP içeren bir ekstraksiyon tamponu eklenir. Karışım daha sonra inkübe edilir, soğutulur ve çift damıtılmış su içinde seyreltilir. Mantıklı görünüyor ama ne yazık ki bu metot herhangi bir saflaştırma adımından yoksun olduğu için çoğu zaman yanlış veya güvenilmez sonuçlara yol açar. Bu yöntemle, karmaşık olmayan örneklerden (Gram-pozitif bakteriler gibi) nükleik asitler ekstrakte edilebilse de PCR inhibitörleri de birlikte ekstrakte edildiğinden ve tampon maddeler (örn. EDTA) taşınıp aşağı akış uygulamalarını ciddi bir şekilde etkilediğinden artık kullanılmamaktadır. Bunun da ötesinde, qPCR veya yeni nesil dizileme (NGS) gibi günümüz uygulamaları çok hassastır ve yüksek saflıkta nükleik asitler gerektirir.

Chelex 100 ekstraksiyonu

Chelex 100 ekstraksiyonu için numuneye Chelex 100 reçinesi, SDS, NP40 ve Tween® 20 içeren bir ekstraksiyon tamponu eklenir. Karışım 100°C’de 30 dakika inkübe edilir, ardından santrifüjlenir. Süpernatan uzaklaştırılır ve 10 mM Tris-HCl ve 1 mM EDTA’nın nihai konsantrasyonuna ayarlanır. Saflaştırma adımlarının olmaması nedeniyle, bu yöntem de düşük saflıkla sonuçlanır ve PCR inhibitörlerini karmaşık matrislerden verimli bir şekilde uzaklaştıramaz. Ek olarak, protokolün yüksek sıcaklığı ve alkalilik seviyesi DNA’yı denatüre edebilir. Bu nedenle Chelex 100 ekstraksiyonu, spin kolon ekstraksiyonu gibi alternatif metotların aynı sürede çok daha iyi sonuçlar sunduğu günümüzde nadiren kullanılmaktadır.

Ayrıca, geleneksel nükleik asit ekstraksiyon metotları hem kimyasal hem de fiziksel hücre lizis adımları gerektiren, parçalanması zor numuneler (örneğin maya, insan numunesi, hayvan dokusu veya bitki materyali) için uygun değildir.

En Yaygın NAE Metotları

Artık çoğu laboratuvar, spin kolon veya manyetik boncuk ekstraksiyonu iş akışları için numuneye ve uygulamaya özel kitler kullanarak nükleik asitleri izole ediyor. Ancak bu metotlara ayrıntılı olarak bakmadan önce, solüsyon bazlı bazı metotlardan kısaca bahsedeceğiz. Bunlar, spin kolon veya manyetik boncuk ekstraksiyonu ile istenen çıktıyı sağlamayan numune türleri (örn. toprak veya toz gibi büyük partiküllü veya kemostat kültürleri gibi yüksek hacimli numuneler) için faydalı olabilir.

Solüsyon bazlı metotlar

EthBr ile CsCl yoğunluk gradyan santrifüjü

Etidyum bromür (EthBr) ile sezyum klorür (CsCl) yoğunluk gradyanlı santrifüj kullanarak nükleik asitleri ekstrakte etmek için, parçalanmış numuneleri CsCl ve EthBr ile karıştırıp bunları yüksek hızlı santrifüjlemeye tabi tutmak gerekmektedir. CsCl son derece yoğun bir tuzdur ve bir konsantrasyon gradyanı oluşturacaktır, oysa EthBr yoğunluklarına göre bantlara ayrılan nükleik asitlere karışacaktır. EthBr, UV ışığı altında floresan hale geldiğinden, nükleik asit bantları kolayca bulunabilir ve ekstrakte edilebilir. EthBr daha sonra etanol çökeltmesi kullanılarak ekstrakte edilen nükleik asitlerden uzaklaştırılabilir.

Bu yöntemin avantajı, yüksek saflıkta nükleik asitleri verimli bir şekilde sağlamasıdır. Bununla birlikte zahmetli ve uzun süren bir işlem olması dezavantajlarıdır. Çünkü numunelerin en az 24 saat santrifüjlenmesi gerekir. Aynı zamanda yüksek maliyetlidir çünkü muhtemelen başka türlü ihtiyaç duyulmayacak bir ekipman olan pahalı bir ultrasantrifüje gereklidir. Bir mutajen olduğu için EthBr ile çalışırken de dikkatli olunmalıdır. Bu nedenle, laboratuvarınızda bu nükleik asit ekstraksiyon metodunu kullanmayı planlıyorsanız, EthBr’yi içeren pipetleme adımları için bir biyogüvenlik kabinine ihtiyacınız olacaktır.

Fenol-kloroform ekstraksiyonu

Fenol-kloroform ekstraksiyonlarını gerçekleştirmek için, parçalanmış numuneleri bir fenol-kloroform çözeltisi ile karıştırmak ve birkaç dakika santrifüjlemek gerekir. Santrifüjden sonra, üç faz görülür: üstte nükleik asitler içeren bir sulu faz, bir altta lipidlerin organik fazı ve proteinlerden oluşan bir interfaz. Sulu faz uzaklaştırılır ve DNA’yı saflaştırmak ve konsantre etmek için etanol çökeltmesi kullanılır. RNA’yı ekstrakte etmek için numuneler santrifüjlenmeden önce fenol-kloroform karışımına guanidinyum izotiyosiyanat eklenir. Bu işlem, numuneleri RNA içeren bir üst faza ve DNA ve proteinleri içeren bir alt faza ayıracaktır. RNA’yı üst fazdan çökeltmek için izopropanol eklenir.

EthBr ile CsCl yoğunluk gradyan santrifüjü gibi, fenol-kloroform ekstraksiyonu da yüksek verim sağlar ve ultrasantrifüj yerine sadece bir santrifüje ihtiyaç olduğundan, çok daha hızlı ve daha ekonomiktir. Bununla birlikte, aşağıdaki katı faz ekstraksiyon metotlarıyla karşılaştırıldığında hala çok zaman alan bir yöntemdir. Ayrıca genellikle manuel olarak gerçekleştirilmesi gerektiği için daha yüksek değişkenlik ve daha düşük tekrarlanabilirliğe neden olur. Ek olarak, fenol ve kloroform uçucu ve yüksek derecede toksik olduğundan ve açık bir tezgahta ele alınmaması gerektiğinden, fenol-kloroform ekstraksiyonları gerçekleştirmek için yalnızca bir santrifüj değil, aynı zamanda bir kimyasal çeker ocak ihtiyacı vardır.

Katı faz ekstraksiyon metotları

Özetle, katı faz ekstraksiyonu şu şekilde tanımlanabilir: nükleik asitler, silika membran veya manyetik boncuklar gibi katı bir yüzeye bağlanır. İstenmeyen bağlanmamış malzemeler yıkanır ve nükleik asitler daha sonra katı fazdan ayrılır. Daha ayrıntılı olarak inceleyeceğimiz en yaygın iki katı faz ekstraksiyon yöntemi, spin kolon ekstraksiyonu ve manyetik boncuk ekstraksiyonudur.

Spin kolon ekstraksiyonu

Spin kolon ekstraksiyonu genellikle belirli bir kit ile yapılır. Piyasada bulunan çeşitli kitler birbirinden biraz farklıdır ancak hepsi aynı temel prensibi takip eder. İlk olarak, bir lizis tamponu ekleyerek numuneleri parçalamak gerekir. Kimyasal lizis genellikle hücre zarını parçalamak için boncuk dövme veya sallama gibi fiziksel yöntemlerle birleştirilir. Daha sonra örnekler spin kolonlara aktarılır. Bunlar santrifüjlenir ve nükleik asitler kolonun içindeki membrana bağlanırken diğer istenmeyen maddeler de içinden geçer. Bağlı olmayan tüm bileşenleri yıkamak için bir yıkama tamponu ile birkaç santrifüjleme adımı gereklidir. Sonunda, nükleik asitleri zardan serbest bırakmak için spin kolonlarına bir elüsyon tamponu eklemek ve nükleik asitleri ayrıştırmak için son bir kez santrifüjlemek gerekir.

Spin kolonları, ayrı kolonlar olarak veya 96 kuyucuklu bir formatta mevcuttur. 96 kuyucuklu silika membran plakaları, santrifüj edilmek yerine bir vakum manifolduna da yerleştirilebilir. Bu, laboratuvarda bu metodu gerçekleştirmek için bir santrifüj veya pompalı bir vakum manifolduna ihtiyaç olduğu anlamına gelir. Spin kolon ekstraksiyonunun avantajları, hızlı ve kolayca gerçekleştirilebilmesi ve eldeki numune sayısına uyarlanabilmesidir. Birkaç örnek için tek kolonlar, daha yüksek verim için 96 kuyucuklu format kullanılabilir. Bu yöntemin başlıca dezavantajları, mambranın bazen tıkanabilmesi ve minimum 30-50 µl elüsyon hacminin gerekli olması, bunun da daha düşük nükleik asit konsantrasyonlarına yol açmasıdır.

Manyetik boncuk ekstraksiyonu

nyetik boncuk ekstraksiyonu işlemi de özel kitlerle yapılmaktadır. Spin kolon ekstraksiyon yöntemlerinde olduğu gibi, hücreleri parçalamak için bir lizis tamponuna ve örneğe bağlı olarak fiziksel bir lizis yöntemine gereksinim vardır. Numune lizisinden sonra numunelerin nükleik asitlerini bağlayan manyetik boncuklar eklenir. Tüpler daha sonra bir mıknatıs üzerine yerleştirilir ve istenmeyen bağlanmamış materyali çıkarmak için süpernatan aspire edilir. Bu adım, aralarda yıkama tamponu değiştirilerek birkaç kez tekrarlanır. Son aşama için, numuneleri farklı bir kaba aktarmadan önce nükleik asitleri boncuklardan ayırmak için bir elüsyon tamponu eklenir.

Bu metodun en büyük avantajı, ekipmanın bütçeye göre uyarlanabilmesidir. Temel olarak, manyetik boncuk çıkarma için gerekli olan tek şey bir manyetik stanttır. Ancak, iş akışı manuel olarak gerçekleştirmek istenmiyorsa bunun için özel bir saflaştırma sistemi de satın alınabilir. Bu saflaştırma sistemi, manyetik boncuklarla da çalışır ancak genel olarak farklı tamponlarla önceden doldurulmuş kaplar kullanır ve daha sonra boncukları manyetik çubuklar aracılığıyla bir kaptan diğerine aktarır. Manuel pipetleme adımlarını azaltmak isteyen ancak özel saflaştırma sistemine ayıracak bütçesi olmayanlar için üçüncü bir seçenek, masaüstü pipetleme robotu ya da 96 veya 384 kanallı bir elektronik pipet satın almaktır. Her iki cihaz da manuel sıvı aktarma adımlarını azaltarak verimi artırır ve ayrıca laboratuvardaki diğer uygulamalar için de kullanılabilir.

Spin kolon ekstraksiyonu yöntemiyle karşılaştırıldığında, manyetik boncuk ekstraksiyonu daha düşük elüsyon hacimleriyle çalışabilir ve 384 kuyucuklu formatta çalışılabileceği için verimlilik daha kolay arttırılabilir. Bununla birlikte, manyetik boncukları aspire etmemeye dikkat edilmesi gerektiğinden, manyetik boncuk ekstraksiyon işlemini manuel olarak gerçekleştirmek daha zor ve hataya açıktır.

INTEGRA hangi NAE metodunu seçti?

Başta açıklandığı gibi, INTEGRA yakın zamanda kendi bünyesinde yeni bir laboratuvar kurdu ve ne tür bir nükleik asit ekstraksiyon yöntemi kullanacağına ve hangi ekipmanı satın alacağına karar vermesi gerekti.

INTEGRA sonunda hem spin kolon hem de manyetik boncuk ekstraksiyon yöntemleriyle çalışmaya karar verdi ve bir santrifüj, vakum manifoldu ve pompa ve manyetik stantlar satın aldı. Bu onlara çok çeşitli kitlerle çalışma ve farklı verimlilik gereksinimlerini karşılama esnekliği sağladı. Çok düşük bir numune sayıları varsa, tek spinli kolonlar ve santrifüj kullanarak nükleik asitleri hızlı bir şekilde elde edebilirler. Daha yüksek numune sayıları için 96 kuyucuklu silika membran plakaları ve vakum manifoldunu veya manyetik boncuk ekstraksiyon metodunu kullanabilirler.

Sonuç

Farklı nükleik asit ekstraksiyon metotlarının değerlendirilmesinin laboratuvarlar için ekipman seçiminde yardımcı olacağını umuyoruz. Bir moleküler biyoloji laboratuvarının sıfırdan nasıl kurulacağına dair blog serimizin bir sonraki bölümünde, PCR söz konusu olduğunda nelere dikkat etmeniz gerektiğine odaklanacağız.

Kaynak: https://www.integra-biosciences.com/global/en/blog/article/essential-equipment-nucleic-acid-extraction