Bir PCR Laboratuvarı Nasıl Kurulur?

PCR, qPCR ve RT-PCR nasıl çalışır?

Gerçek zamanlı ve ters transkripsiyonlu PCR, genellikle “RT-PCR” olarak kısaltılır ancak bunlar aynı şey değildir. Hepimizin aynı şeyi anladığından emin olmak için her bir tekniği daha detaylı incelemeden önce PCR, qPCR ve RT-PCR kısaltmaları arasındaki farklara kısaca değinelim:

PCR: Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), spesifik DNA segmentlerini amplifiye etmek için kullanılan hızlı ve uygun maliyetli bir tekniktir. İlk olarak, numune ısıtılır, böylece DNA denatüre olur (iki tek sarmala ayrılır). Sıcaklık, DNA’nın tamamlayıcı bir kopyasını oluşturmasını sağlayacak şekilde polimeraz enziminin optimum çalışma sıcaklığına yükseltilmeden önce, oligonükleotitlerin tek sarmallı DNA’nın belirli bölümleriyle birleşmesine izin vermek için düşürülür. Teorik olarak, bu adımların bir kez tekrar edilmesi veya “termal döngüsü” reaksiyonda bulunan spesifik DNA miktarını iki katına çıkarır. Başlangıçta bulunan DNA miktarına ve PCR sonrası uygulamalar için gereken amplikon kopyalarının sayısına bağlı olarak, genellikle 25 ila 40 döngü gerçekleştirilir.

İlginç bir bilgi: PCR’lerde genel olarak kullanılan polimeraz enzimi, orijinal olarak Thermus aquaticus bakterisinden izole edildiğinden Taq-polimeraz olarak adlandırılır. İlk olarak 1960’larda Yellowstone Milli Parkı’ndaki bir sıcak su kaynağında keşfedilen bu enzim, DNA denatürasyonu için gerekli olan yüksek sıcaklıklara dayanabilir.

qPCR: Gerçek zamanlı PCR, kantitatif PCR veya kantitatif gerçek zamanlı PCR olarak da adlandırılan qPCR, hedef nükleik asitlerin üretilirken amplifikasyonunu saptamak ve ölçmek için kullanılan bir tekniktir. Geleneksel PCR’lerin aksine, qPCR’ler, floresan olarak etiketlenmiş bir oligonükleotid probu ve floresanı ölçebilen ve eşik döngüsü (CT) değerini hesaplayabilen bir termocycler (ısı döngüleyici) gerektirir. Tipik olarak, floresan, oluşan PCR ürününün konsantrasyonuyla doğru orantılı olarak artar, bu da hedef miktarların gerçek zamanlı olarak ölçülmesine olanak tanır.

RT-PCR: Ters (reverse) transkriptaz PCR (RT-PCR), haberci RNA (mRNA) ve viral RNA genomları gibi RNA hedef dizilerini kopyalamak için kullanılır. Bu tip PCR, PCR amplifikasyonundan önce numune RNA’sının bir ters transkriptaz enzimi ve bir DNA primeri (diziye özgü, oligo dT veya rastgele heksamer) ile ilk inkübasyonunu içerir.

RT-PCR kısaltması bazen ters (reverse) transkriptaz PCR’si yerine gerçek zamanlı PCR için de kullanılır. Gerçek zamanlı PCR, kantitatif PCR veya kantitatif gerçek zamanlı PCR olarak da adlandırıldığından, gerçek zamanlı PCR’ın qPCR olarak kısaltılması gerektiğini düşünüyoruz.

PCR reaksiyonları çok hassastır ve çok küçük miktarlardaki başlangıç materyalinden çok sayıda nükleik asit kopyası oluşturur. Bu nedenle PCR reaksiyonları, temel ve oldukça etkili moleküler biyoloji teknikleridir. Ancak, amplikon ve numune kontaminasyonuna yatkın oldukları için, PCR laboratuvarı alanının planlanması ve tasarımının dikkatli bir şekilde yapılması gerekir.

PCR laboratuvarı tasarlama

İdeal olarak, bir PCR laboratuvarında, her biri belirli görevler için tasarlanmış iki alana sahip iki oda olmalıdır. İlk oda, yalnızca PCR öncesi uygulamalar için kullanılmalı ve bir master mix hazırlama alanı ve bir numune hazırlama alanı olarak bölünmelidir. Aerosollerin içeri girmesini önlemek için hava basıncı bir miktar pozitif olmalıdır.

İkinci oda, nükleik asit amplifikasyonu için ayrılmış bir alana ve ürün analizi için başka bir alana sahip olmalıdır. Amplikon aerosollerinin odadan çıkmasını engellemek için hava basıncı bir miktar negatif olmalıdır.

İki odalı bir PCR laboratuvarı için yeterli alan ya da bütçe yoksa, PCR öncesi ve amplifikasyon ve analiz alanları aynı odaya kurulabilir, ancak birbirlerinden mümkün olduğunca uzak olduklarından emin olunmalıdır.

PCR öncesi aktivitelerin amplifikasyon ve analiz alanından farklı odalar veya ayrı tezgahlar olarak ayrılmış olması çok önemlidir çünkü hazırlama sırasında genellikle düşük miktarda nükleik asit numunesine ve amplifikasyondan sonra çok yüksek bir konsantrasyona sahip olunur. Bu, master mix ve numunelerin hazırlandığı aynı alanda PCR analiz edilirse amplikon kontaminasyonu nedeniyle yanlış pozitif sonuçlar alınabileceği anlamına gelir.

Ayrıca laboratuvar kurulumunun tek yönlü bir iş akışını izlediğinden emin olunmalıdır. Amplifikasyon ve analiz alanlarında kullanılan hiçbir materyal veya reaktif, tam bir dekontaminasyon yapılmadan PCR öncesi alana asla alınmamalıdır. Bu, her alan için özel ekipmana (örneğin iki farklı pipet seti gibi) ihtiyacınız olacağı anlamına gelir. Bu tek yönlü iş akışı, laboratuvar personeli için de geçerli olmalıdır. Amplifikasyon ve analiz alanlarında çalışanların PCR öncesi alana geri dönmesi gerekirse amplikon aerosolleri ile kontamine olmuş olabileceğinden kişisel koruyucu ekipmanlar değiştirilmelidir.

Bir PCR laboratuvarı kurarken göz önünde bulundurulması gereken bir diğer önlem, mekansal ayırmaya ek olarak zamansal ayırmadır. Örneğin, PCR reaksiyonları sabah saatlerinde, amplifikasyon ve analiz adımları öğleden sonra gerçekleştirilebilir. Bu, esnekliği sınırlayabilir, ancak kontaminasyon sorunlarını ve test tekrarı zorunluluğunu ortadan kaldırır.

PCR ekipmanı için ipuçları

PCR laboratuvarları genel olarak santrifüjler, vorteks karıştırıcılar, pipetler, buzdolapları ve dondurucular, termocycler (ısı döngüleyiciler) ve analiz cihazları (örneğin elektroforez sistemleri) gibi çeşitli ekipmanlara ihtiyaç duyar. PCR laboratuvarının boyutuna ve uygulamalarına bağlı olarak, ihtiyaç duyulacak ekipman miktarı değişebilir. Size bir “alışveriş listesi” vermek yerine, PCR reaksiyonlarınızın kontaminasyonunu minimum seviyede tutmak için ekipman ve sarf malzemeleri satın alırken nelere dikkat etmeniz gerektiğini özetleyeceğiz.

Laminer akış veya biyogüvenlik kabini

PCR öncesi alanda amplikon aerosolleri olmadığından asla %100 emin olunamayacağı için PCR reaksiyonları, işe başlamadan önce ve bitirdikten sonra bir çamaşır suyu solüsyonuyla dekontamine edilmiş bir laminer akış veya biyogüvenlik kabinine kurulmalıdır.

Pipet uçları ve diğer sarf malzemeleri

Normal pipet uçlarından daha pahalı olmasına rağmen PCR kurulumu için filtre uçlarının kullanılması aerosollerin pipete girmesini ve pipeti kontamine etmesini ve pipette zaten mevcut olabilecek aerosollerin master mixi veya numuneleri kirletmesini önleyecektir. Filtre ucu tüketimini en aza indirmek için önce tüm tüpler yalnızca bir uç veya uç seti kullanarak (çok kanallı pipetler kullanılıyorsa) master mixle doldurulabilir ve numune başına bir uç kullanarak örneklerle devam edilebilir. Numuneyi en son eklemek de önerilen bir uygulamadır çünkü numuneyi bir sıvıya aktarmak boş bir tüpe aktarmaktan daha kolaydır ve pipetlerken numuneyi aerosol haline getirme riskini azaltır. Aerosol oluşumunu önlemeye yardımcı olacak en iyi pipetleme uygulamalarını öğrenmek için bu blog yazısını okuyabilirsiniz.

Sarf malzemeleri için; PCR reaktifleri geldiğinde laboratuvarda yeterli sayıda vial bulunduğundan emin olunmalıdır. Bunları daha küçük kaplara bölmek, raf ömürlerini arttıracak ve çok fazla donma/çözülme döngüsünden geçmelerini önleyecektir. Reaktifler kontamine olursa ikinci bir PCR için temiz alikotlar mevcut olacağından tüm kaynağı çöpe atmaktan da kurtaracaktır.

Son olarak, tüm sarf malzemelerinin ve ekipmanın DNase, RNase ve PCR inhibitörleri içermediğinden emin olunması gerekir. Her zaman uç ve sarf malzemelerinde bu potansiyel kirleticilerden arınmış olduğunu sertifikalandırabilen üreticilerin steril ürünleri seçilmelidir.

Temizlik ve kontaminasyon kontrolü

Laboratuvar kurulurken temizlik veya kontaminasyon kontrolü konusunda endişelenmeye gerek yoktur ancak laboratuvar hazır ve çalışır durumdayken temizlik ve kontaminasyon kontrolü çok önemlidir. Aşağıda bu konuya kısaca değinilecek.

PCR reaksiyonları ister bir çeker ocak altında ya da bir biyogüvenlik kabininde, isterse de açık bir tezgahta gerçekleştirilecek olsun, kurulumdan önce ve sonra çalışma alanının taze yapılmış bir çamaşır suyu solüsyonu ve damıtılmış su ile silinerek dekontamine edilmesi gerekecektir. Amplifikasyon ve analiz alanlarında da aynı işlem yapılmalıdır. Ayrıca pipetlerin, ekipmanların, kapı kollarının, buzdolabı ve derin dondurucuların kollarının da düzenli olarak temizlendiğinden emin olunmalıdır.

PCR testleri çok hassas olduğu için burada açıklanan tüm önleyici tedbirler yine de deneylerin asla kontamine olmayacağını garanti etmeyebilir. Bu nedenle, kontaminasyonu erken tespit etmek için uygun kontrollerin dahil edilmesi gereklidir. Master mix kontaminasyonlarını belirlemeye ve ekstraksiyon protokolünün, reaktiflerin ve amplifikasyon adımlarının performansını doğrulamaya yardımcı olacağından, her zaman negatif ve pozitif kontroller dahil edilmelidir. Ek olarak, laboratuvardaki pozitiflik oranı izlenmeli ve beklenmeyen artışların tespit edilmesinin, örneğin mevsimsel bir salgın gibi, tanımlanabilir nedenleri olduğundan emin olunmalıdır.

Sonuçlar

PCR laboratuvarınızı kurma konusunda hala aynı heyecanı yaşadığınızı ve bu blog yazısının bu kurulumu sizin için daha az göz korkutucu hale getirdiğini umuyoruz. Sonraki nükleik asit miktar tayini iş akışları için neye ihtiyacınız olacağını merak ediyorsanız, moleküler biyoloji laboratuvarı kurulum serimizin üçüncü bölümünü okuyabilirsiniz.

Kaynak: https://www.integra-biosciences.com/global/en/blog/article/setting-pcr-lab-scratch