Nükleik Asitler Nasıl Saflaştırılır?

Etanol ve izopropanol çökeltme

İnceleyeceğimiz ilk saflaştırma yöntemi etanol ve izopropanol çökeltmesi. Bu metot, genomik DNA’yı saflaştırmak için tercih edilen yöntemdir ve EthBr ile CsCl yoğunluk gradyan santrifüjleri, fenol-kloroform ekstraksiyonları, yakma ve PCR’ler gibi uygulamalardan sonra nükleik asit numunelerini konsantre etmek ve tuzdan arındırmak için kullanılabilir.

Nasıl çalışır?

Etanol ve izopropanol çökeltmesi tamamen çözünürlükle ilgilidir. Su ve nükleik asitlerin her ikisi de polar moleküller olduğu için nükleik asitler suda kolayca çözünür. Bunları çökeltmek için etanol veya izopropanol kullanabilirsiniz.

Etanol çökeltmesi için, çözeltiye numune hacminin iki katı buz soğukluğunda %96 etanol ve tuz (genelde sodyum asetat) eklemeniz gerekir. Etanol, dielektrik katsayısını düşürerek şeker-fosfat omurgasındaki negatif yüklerin sodyum asetatın Na+ iyonları tarafından nötralize edilmesini sağlar. Nükleik asitler böylelikle daha az hidrofilik hale gelir ve karışımı buz üzerinde inkübe ettiğinizde çözeltiden ayrılırlar. Ardından nükleik asitleri diğerlerinden ayırmak için numune santrifüjlenir ve kalan tuzu çıkarmak için pelet soğuk %70 etanolde yıkanır. Numune ikinci kez santrifüjlenir, etanol çıkarılır, nükleik asit peletinin kuruması beklenir ve temiz bir sulu tampon çözeltide yeniden süspanse edilir. Nükleik asit peletini kurutmak için tüp (kapak açıkken) birkaç saat boyunca laminer çeker ocağa yerleştirilebilir veya bir vakum santrifüj kullanılabilir. Seçilen metot kullanıcıya bağlıdır ancak etanol kalıntısının aşağı akış uygulamalarını olumsuz etkilemesini önlemek için peletin tamamen kuru olduğundan emin olunmalıdır.

İzopropanol çökeltmesi çok benzerdir. Tek fark, buz adımında inkübasyonun atlanabilmesi ve ilk adım için buz sıcaklığındaki etanolün oda sıcaklığında izopropanol ile değiştirilebilmesidir. Numune hacmine eşit hacimdeki izopropanol hacmi yeterlidir.

Etanol veya izopropanol çökeltmesinin hangisinin daha uygun bir metot olduğu numune hacmine, konsantrasyona ve nükleik asit parçalarının boyutuna bağlıdır. Büyük bir numune hacmi varsa tüpe numune hacminin iki katı etanol eklemek imkansız olabilir. Nükleik asitler izopropanol içinde daha az çözünür olduğu için daha büyük nükleik asit parçalarının ve daha düşük numune konsantrasyonlarının çökeltilmesi için izopropanol çökeltmesi de tercih edilir. Bunun da ötesinde, numuneleri santrifüjlemeden önce inkübe etmek gerekmediğinden izopropanol çökeltme daha hızlı olan yöntemdir.

Avantajlar ve dezavantajlar

Etanol, izopropanol ve sodyum asetat oldukça ucuz olduğu ve işlem yüksek saflıkta iyi bir nükleik asit verimi sağladığı için etanol ve izopropanol çökeltme maliyetli değildir. Bununla birlikte, çok zaman alan bir süreçtir ve manuel olarak gerçekleştirilmesi gerektiği için oldukça değişkendir. Dolayısıyla düşük tekrarlanabilirlik bir sorun olabilir.

Gerekli ekipman

Etanol veya izopropanol çökeltme için ihtiyacınız olan tek şey bir santrifüj ve laminer çeker ocak veya peleti kurutmak için bir vakum santrifüjüdür.

Jel elektroforezi ve spin kolon saflaştırma

Jel elektroforezi, nükleik asitleri uzunluklarına göre ayırdığı için ilgili nükleik asitleri diğer nükleik asit türlerinden ve kirleticilerden ayırmak için bu yöntemi kullanabilirsiniz.

Nasıl çalışır?

Her şeyden önce, bir jel çalıştırmanız gerekir. Agaroz jel elektroforezinin nasıl gerçekleştirileceği hakkında daha ayrıntılı bilgi, nükleik asit miktar tayini ve görselleştirme hakkındaki makalemizin 1. bölümünde bulunabilir.

Jelinizi görselleştirdikten sonra, ilgilenilen nükleik asit bandını çıkarmak için keskin bir neşter kullanılabilir. Özellikle bantların görselleştirilmesi için UV ışığı kullanırken, bu adım için daima uygun KKD (yüz siperi ve eldiven) kullanmak unutulmamalıdır. Ardından, uygun bir spin kolon saflaştırma kiti kullanarak nükleik asit bantları TAE veya TBE tamponlu agaroz jelden arındırılır. Mevcut kitler birbirinden biraz farklı olduğundan üreticinin talimatları dikkatlice izlenmelidir. Genellikle, nükleik asit bantlarını tartmak, her 100 mg jel dilimi için belirli bir miktarda tampon eklemek ve agarozu çözündürmek için karışımı ısıtmak gerekir. Daha sonra numuneler spin kolonlarına aktarılır ve bağlama, yıkama ve elüsyon adımları kullanılaarak nükleik asitler saflaştırılır. Spin kolon protokollerinin nasıl çalıştığı hakkında daha ayrıntılı bilgi, nükleik asit ekstraksiyonu hakkındaki makalemizin 2.2.2.1 bölümünde bulunabilir.

Avantajlar ve dezavantajlar

Bu nükleik asit saflaştırma metodunun en büyük avantajı, agarozun nükleik asitleri denatüre etmemesi ve bunların jelden herhangi bir zarar vermeden geri kazanılmasını kolaylaştırmasıdır. Bununla birlikte, yüksek verim gereken laboratuvarlar için uygun değildir çünkü bir jelin çalıştırılması çok zaman alır ve düşük sayıda numune ile sınırlıdır.

Gerekli ekipman

Diğer saflaştırma yöntemleriyle karşılaştırıldığında, bu iş akışı için birçok farklı ekipmana ihtiyaç vardır. Agaroz jel elektroforezi, tehlikeli interkalasyon boyaları ile çalışıldığı için bir jel elektroforez sistemi, harici bir güç kaynağı ve bir biyogüvenlik kabini gerektirir. Yalnızca bir santrifüj yeterli oldğu için spin kolon saflaştırması daha az ekipmanla uygulanabilir.

Spin kolon saflaştırma

Spin kolonları sadece parçalanmış numunelerden nükleik asitleri ekstrakt etmek için değil, aynı zamanda onları saflaştırmak için de kullanılır; örneğin bir PCR reaksiyonundan sonra takip eden uygulamaları inhibe edebilecek tuzları, enzimleri, primerleri, primer-dimerleri ve nükleotitleri uzaklaştırmak için.

Nasıl çalışır?

Yukarıda açıklandığı gibi, spin kolon saflaştırma protokolleri bağlama, yıkama ve elüsyon adımlarından oluşur. Numunleri spin kolonlarına aktardıktan sonra, nükleik asitleri kolonun içindeki membrana bağlamak için santrifüj edilir. Bu, istenmeyen bileşenlerin de membrana geçmesine izin verir. Bir yıkama tamponu ile birkaç ek santrifüjleme aşaması, istenmeyen artık maddeleri uzaklaştırır ve bir elüsyon tamponu ile bir son santrifüjleme aşaması, nükleik asitleri membrandan serbest bırakır.

Avantajlar ve dezavantajlar

Görüldüğü gibi, bu saflaştırma yöntemi hızlı ve kolaydır. Bunun da ötesinde, tek spinli kolonlar yerine 96 kuyucuklu silika membran plakaları kullanılabileceği için numune sayınıza uyarlanabilir. Ancak, membran tıkanabilir ve minimum 30-50 µl elüsyon hacmi gerektiği için oldukça düşük nükleik asit konsantrasyonları elde edilebilir.

Gerekli ekipman

Spin kolon saflaştırma için gereken tek ekipman, 96 kuyucuklu formatta çalışılmadığı ve pompalı bir vakum manifoldu kullanmak tercih edilmediği sürece bir santrifüjdür.

Manyetik boncuk saflaştırma

Spin kolonu gibi manyetik boncuklar da hem parçalanmış numunelerden nükleik asitlerin ekstraksiyonu için hem de nükleik asitlerin saflaştırılması için kullanılabilir. Örneğin, sonraki uygulamaları engelleyebilecek olan tuzları, enzimleri, primerleri, primer dimerleri ve nükleotitleri PCR ürünlerinden uzaklaştırmak için manyetik boncuklar kullanılabilir.

Nasıl çalışır?

Manyetik boncuklarla yapılan saflaştırma iş akışı, ekstraksiyon iş akışına çok benzerdir. Önce numunelere nükleik asitleri bağlayan manyetik boncuklar eklenir.

Daha sonra tüpler bir mıknatısın üzerine yerleştirilir, istenmeyen, bağlanmamış malzeme içeren süpernatant uzaklaştırılır. Aralarda yıkama tamponunu değiştirerek bu adım birkaç kez tekrarlanır. Sonra bir elüsyon tamponu eklenir ve numuneler farklı bir kaba aktarılır.

Manyetik boncuklarla gerçekleştirilen ekstraksiyon protokollerinin aksine, saflaştırma sırasında yalnızca belirli bir uzunluktaki nükleik asit fragmanları boncuklara bağlanır. Bu boyut dışlama mekanizması, tamponları, tuzları ve bunların konsantrasyonlarını ve dolayısıyla hidrofilisite/hidrofobikliği değiştirip ilgilenilen nükleik asit fragmanları için mükemmel bağlanma koşulları yaratarak elde edilir.

Avantajlar ve dezavantajlar

Manyetik boncuk saflaştırmanın büyük bir avantajı, gerekli ekipmanın bütçeye göre seçilebilmesidir.

Seçenek 1: Manyetik bir stant alınır ve iş akışı manuel olarak gerçekleştirilir. Bu en ucuz seçenektir, ancak aynı zamanda en yorucu ve hataya açık yöntemdir. Boncukları aspire etmemek için çok dikkatli olmak gerekir, çünkü bu numune kaybına neden olabilir.

Seçenek 2: Yüksek verimli uygulamalar için, bir masaüstü pipetleme robotu veya 96 veya 384 kanallı pipet de satın alınabilir. Bu cihazlar, manuel sıvı transferi adımlarını azaltır, verimive tekrarlanabilirliği artırır ve diğer uygulamalar için de kullanılabilir. Bu tür cihazların manyetik boncuk saflaştırma için nasıl kullanılabileceği hakkında daha fazla bilgi için, MACHEREY-NAGEL’in NucleoSpin® 96 Plazmit kiti ile plazmid DNA saflaştırması, Beckman Coulter AMPure XP manyetik boncukları ve ASSIST PLUS ile PCR saflaştırması ve Beckman Coulter AMPure XP manyetik boncuklar ve VIAFLO 96 ile PCR saflaştırması hakkındaki uygulama notlarımızı inceleyebilirsiniz.

Seçenek 3: Bu yönteme özel bir saflaştırma sistemi satın alarak tüm iş akışı otomatikleştirilebilir.

Manyetik boncuk saflaştırmanın bir diğer kolaylığı, spin kolon saflaştırmasına göre daha düşük elüsyon hacimleriyle çalışılabilmesi ve 384 kuyucuklu plaka ile kullanılabileceği için daha kolay ölçeklenebilir olmasıdır.

Gerekli ekipman

Açıklandığı gibi manyetik boncuk saflaştırma ekipmanı bütçeye göre belirlenebilir. Sınırlı bir bütçe varsa bir manyetik stand, daha fazla bütçe varsa bir masaüstü pipetleme robotu veya 96 veya 384 kanallı bir pipet ya da özel bir saflaştırma sistemi ile tercih edilebilir.

Sephadex® saflaştırma

Sephadex saflaştırma yöntemi nükleik asitleri daha küçük moleküllerden, örn. primerler, nükleotidler veya boyalardan ayırmak için kullanılabilir.

Nasıl çalışır?

Sephadex, epiklorohidrin ile çapraz bağlanmış dekstrandan yapılmış bir jel filtrasyon reçinesidir. Reçineyi hazırlamak için, kolonları döndürmek için Sephadex tozu eklemek, suyla yeniden nemlendirmek ve fazla suyu gidermek için kolonları santrifüjlemek gerekir. Kolonları ikinci kez döndürmeden önce numuneler reçinenin üzerine eklenmelidir. Santrifüjleme sırasında, daha büyük moleküller reçineyi kolayca geçer ve ayrışırken daha küçük moleküller dekstran taneciklerinin gözeneklerinde sıkışıp kalır. Boncukların boyut dışlama kapasitesi, seçilen Sephadex tipine bağlıdır. Örneğin, Sephadex G-25 Medium, moleküler ağırlığı >5000 olan nükleik asitleri saflaştırmak için kullanılabilir ve G-50 Medium, moleküler ağırlığı >30000 olan moleküller için uygundur.
Bu iş akışını hızlandırmak için, bunları kendiniz oluşturmak yerine Sephadex ile önceden paketlenmiş spin kolonları tercih edebilir veya 96 kuyucuklu bir filtre plakasında çalışabilirsiniz.

Avantajlar ve dezavantajlar

Spin kolon saflaştırması gibi bu yöntem de hem spin kolonlarında hem de 96 kuyucuklu filtre plakalarında gerçekleştirilerek verimlilik ihtiyaçları için uyarlanabilir. Molekül-matris bağlama aşamasının olmaması, nükleik asitlerin zarar görmesini de önleyerek bu metodu oldukça hassas bir saflaştırma yöntemi haline getirir. Ancak, özellikle spin kolonlarınızı veya filtre plakalarınızı kendiniz hazırlarken oldukça zaman alıcıdır – Sephadex’in yaklaşık üç saat rehidre olması gerekir – ve otomatik hale getirilemez.

Gerekli ekipman

Sephadex saflaştırma için gerekli olan tek ekipman bir santrifüjdür.

Enzimatik yaklaşımlar

Bazı üreticiler, Sanger dizileme, yeni nesil dizileme veya SNP analizi gibi sonraki uygulamalar numunelerin bağlı olmayan primerler ve dNTP’lerden arınmış olmasını gerektiriyorsa PCR ürünlerini temizlemek için enzimatik yaklaşımlar sunar.

Nasıl çalışır?

Enzimatik yaklaşımlar sadece iki adımdan oluşur. Önce numunelere bir enzim karışımı eklenir ve 37 °C’de 15 dakika inkübe edilir. İnkübasyon sırasında, karışımdaki ilk enzim olan eksonükleaz I, fazla primerleri parçalayacak ve ikinci enzim olan alkalin fosfataz, PCR sırasında tüketilmeyen dNTP’leri defosforile edecektir. Enzimler görevlerini yerine getirdikten sonra enzimleri deaktive etmek için numuneler 15 dakika daha 80 °C’ye kadar ısıtılabilir.

Avantajlar ve dezavantajlar

Hızlı ve kolay olmasının yanı sıra bu metot numune kaybına neden olmaz ve numune sayısına kolayca uyarlanabilir. Tek dezavantajı, yalnızca primerlerden ve dNTP’lerden PCR ürünlerini temizlemek için kullanılabilmesi ve diğer kirleticileri temizlememesidir.

Gerekli ekipman

Enzimatik PCR temizlemeleri için ihtiyacınız olan tek şey bir inkübatördür.

Sonuç

Gördüğünüz gibi, her numune türü, aşağı akış uygulaması ve bütçe için bir nükleik asit saflaştırma yöntemi mevcuttur. Bu makalenin, ihtiyaçlarınız için hangisini seçeceğinizi belirlemenize yardımcı olacağını umuyoruz.

Buraya yalnızca nükleik asit saflaştırma ipuçları için gelmediyseniz, nükleik asitleri ekstrakte etmek, PCR reaksiyonları gerçekleştirmek ve nükleik asitlerin miktarını belirlemek için neye ihtiyacınız olduğunu öğrenmek de ilginizi çekebilir. INTEGRA bu dört bölümlük diziyi, kendisi için aşağıda görülen yeni bir laboratuvar kurma sürecindeyken hazırladı.

 

Kaynak: https://www.integra-biosciences.com/global/en/blog/article/how-do-you-purify-nucleic-acids